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宏基因组二代测序技术在布鲁菌脊柱炎诊治中的应用价值

2024-04-07 95 上传者：管理员

摘要：目的探讨宏基因组二代测序(mNGS)技术在布鲁菌脊柱炎诊治中的价值。方法手术治疗36例布鲁菌性脊柱炎患者，收集术前血液标本和术中病灶区组织标本(髓核、软骨终板、黄韧带、纤维环),采用Giemsa染色、试管凝集试验(SAT)、血培养、多重聚合酶链式反应技术(PCR)检测和mNGS评估不同组织样本。另选取30例椎间盘突出患者作为阴性对照组。结果静脉血的mNGS、SAT、多重PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。髓核的mNGS与多重PCR检测阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。软骨终板、黄韧带和纤维环的mNGS检测阳性率均大于多重PCR检测阳性率(P<0.05)。髓核中多重PCR和mNGS检测阳性率均高于静脉血、软骨终板、黄韧带和纤维环(P<0.05)。敏感性、阴性预测值：mNGS均高于Giemsa染色、血培养和SAT(P<0.05);mNGS与多重PCR检测比较差异均无统计学意义(P>0.05)。临床诊断一致性mNGS最好，多重PCR和SAT较好，Giemsa染色一般，血培养较差。结论 mNGS可以作为布鲁菌脊柱炎的有效检测手段，其敏感性和准确率高，尤其适用于术前无法明确诊断且术后病理结果为阴性但需确诊的患者，可为布鲁菌脊柱炎的精准治疗提供重要的病原学依据。

关键词：
宏基因组二代测序技术
布氏菌性脊柱炎
布鲁菌病
感染
病原学诊断
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布鲁菌病是一种由布鲁菌感染引起的人畜共患传染病。当布鲁菌感染侵入脊柱时，临床上称为布鲁菌脊柱炎[1]。然而，由于布鲁菌脊柱炎临床表现通常不具有特异性，而且其影像学特征可能与其他细菌、真菌、炎症和肿瘤性脊柱疾病相似[2]。因此，需要在物种水平上进行鉴定，以了解该病的流行病学特征并进行准确的诊断，实施有效的控制措施。宏基因组二代测序(m NGS)可以检测样本中所有物种的DNA或RNA，能够快速分析样本中整体微生物群的基因组和转录组并进行微生物基因分型、毒力分析和耐药基因组分析[3,4,5]。本研究回顾性分析2019年12月～2021年12月于北京市房山区良乡医院和首都医科大学附属北京地坛医院骨科行手术治疗的36例布鲁菌脊柱炎患者的临床资料，探讨m NGS对布鲁菌脊柱炎病原学诊断的价值，报道如下。

1、材料与方法

1.1 布鲁菌脊柱炎的诊断标准

布鲁菌脊柱炎尚无统一诊断标准，应结合流行病史、临床表现、影像学表现、实验室检查等进行综合考虑[6]。临床符合以下①②③中的2条以及④⑤⑥中任意1条者可诊断为布鲁菌脊柱炎：① 具有布鲁菌病流行病学史；② 临床有布鲁菌病全身中毒表现及感染性脊柱炎局部症状；③ 影像学检查证实脊柱受累且符合布鲁菌脊柱炎影像学特点；④ 血培养阳性或病理学检查阳性；⑤ 试管凝集试验(SAT)检测阳性； ⑥ 多重聚合酶链式反应技术(PCR)检测阳性。

1.2 病例资料

本组36例，男26例，女10例，年龄42～67(54.41±9.03)岁。临床主要表现为颈部或胸腰背部疼痛，颈椎或胸腰椎活动受限，部分伴有发热、出汗等症状，其中存在神经症状者11例。SAT阳性29例。C-反应蛋白(CRP)0.3～96.1(35.1±30.4)mg/L。红细胞沉降率(ESR)1.0～88.0(40.0±26.7)mm/1 h。累及部位：颈椎1例，胸椎2例，胸腰椎2例，腰椎31例。25例有不同程度牛、羊或其生鲜制品接触史，11例无明确病原接触史。常规采用抗布鲁菌病方案(多西环素+利福平+左氧氟沙星+头孢噻肟钠或头孢曲松钠)治疗2～3个疗程后，全身症状好转但局部症状无明显好转，均行手术治疗。术前留取空腹静脉血，术中收集了病灶区不同部位组织标本(髓核、软骨终板、黄韧带、纤维环)。36例患者术中获取髓核标本36份，组织获取率为100%(36/36);软骨终板标本31份，组织获取率为86.1%(31/36);黄韧带标本27份，组织获取率为75.0%(27/36);纤维环标本18份，组织获取率为50.0%(18/36)。另选取30例椎间盘突出患者作为阴性对照组，以同样的方法收集病理组织和血液标本。

1.3 病理学检查

所有病变组织标本切取后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3次，10%中性甲醛固定24 h, 按照常规石蜡切片程序处理，得到3 μm厚度切片。然后按照染色试剂盒的说明书分别行Gimesa染色、HE染色、抗酸染色，中性树胶封片，在光学显微镜下观察各部位病变组织标本病理改变和布鲁菌分布。Gimesa染色油镜下观察布鲁菌为短紫色短杆菌，病理学发现病灶区任一部位组织标本存在布鲁菌则认定为病理结果阳性，否则为阴性。

1.4 细菌培养

使用半自动BACTEC 9240系统进行血培养。如果在标准的5 d内未检测到布鲁菌生长，则继续孵育15 d, 15 d后在布鲁菌琼脂上进行盲培养。根据其对CO2和H2S生成的需求、脲酶和氧化酶的阳性反应、硫氨酸的生长以及与特异性抗血清的阳性凝集反应进行鉴定。培养出布鲁菌则判定结果为阳性，否则为阴性。

1.5 血清学实验

使用羊布鲁菌抗原进行SAT检测，并使用磷酸盐缓冲盐水(1 ∶10到1 ∶1 280)对血清进行连续稀释。在每根试管中加入0.5 ml 10%的羊布鲁菌溶液，然后在37 ℃下孵育24 h。效价≥1 ∶160时，则判定结果为阳性，否则为阴性。

1.6 多重PCR检测

取空腹静脉血5 ml于带分离胶的真空采血管中，且将手术标本置入一次性容器内，样本容器应密闭、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物。采集后 4 h内送至辽宁康惠生物科技有限公司实验室进行检测，如不能立即送检，应冻存于-70 ℃。多重PCR检测发现静脉血或病灶区任一部位组织标本中存在任何种属的布鲁菌DNA则认定为多重PCR结果为阳性，否则为阴性。

1.7 mNGS

取空腹静脉血5ml于带分离胶的真空采血管中，且将手术标本置入一次性容器内，样本容器应密闭、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物。采集后 4 h内送至辽宁康惠生物科技有限公司实验室进行检测，如不能立即送检，应冻存于-80 ℃。采用基于MGISEQ-2000RS的高通量测序技术，对样本中核酸序列进行分析，通过与自主研发的LMKB数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，从而对微生物进行鉴定，并且与LMARdb耐药数据库比对，鉴定出耐药基因。mNGS检测发现静脉血或病灶区任一部位组织标本中存在任何种属的布鲁菌DNA则认定结果为阳性，否则为阴性。

1.8 评价指标

计算每种检测方法的敏感性(布鲁菌脊柱炎患者中阳性样本占总样本的百分比)、特异性(椎间盘突出患者中阴性样本占总样本的百分比)、阳性预测值(布鲁菌脊柱炎患者中真阳性样本占阳性样本的百分比)和阴性预测值(真阴性样本占所有阴性样本的百分比)。

1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料比较采用χ2检验。通过计算Kappa值来评估5种检测方法的可靠性。

2、结果

2.1 静脉血和组织标本的检测阳性率比较

见表1。静脉血的mNGS、SAT、多重PCR检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。髓核的mNGS与多重PCR检测阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。软骨终板、黄韧带和纤维环的mNGS检测阳性率均高于多重PCR检测阳性率，差异均有统计学意义(P<0.05)。髓核中多重PCR和mNGS检测阳性率均高于静脉血、软骨终板、黄韧带和纤维环，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 5种检测方法的指标比较

敏感性：mNGS高于Giemsa染色、血培养和SAT,差异均有统计学意义(P<0.05);mNGS与多重PCR检测比较差异无统计学意义(P>0.05)。阴性预测值：mNGS高于Giemsa染色、血培养和SAT,差异均有统计学意义(P<0.05);mNGS略高于多重PCR,但差异无统计学意义(P>0.05)。特异性和阳性预测值5种检测方法比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。Giemsa染色、SAT、血培养、多重PCR和mNGS与临床诊断均具有一致性(P<0.01),其中mNGS最好，多重PCR和SAT较好， Giemsa染色一般，血培养较差，见表3。

2.3 典型病例

见图1。

图1 患者，男，56岁，发热伴剧烈腰背部疼痛2个月，临床诊断为布鲁菌脊柱炎，经腰部制动保护、抗布鲁菌病药物治疗、止疼对症等处理后，体温恢复正常，腰背部疼痛未见明显减轻，行腰椎后路病灶清除植骨融合内固定术治疗

表1 静脉血和组织标本检测阳性率[份(%)]

表2 5种检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的比较[例(%)]

表3 5种检测方法诊断布鲁菌脊柱炎的可靠性导出到EXCEL

3、讨论

3.1 布鲁菌脊柱炎的诊断方法

布鲁菌脊柱炎的诊断往往不能单纯依靠常规的临床和实验室检查，需结合许多中检查结果，包括CT、MRI和放射性骨显像。但是布鲁菌脊柱炎和部分脊柱疾病很难区分，其影像学特征均相似[7]。血培养分离出布鲁菌是诊断布鲁菌病的金标准，但是这一过程耗时且存在实验室获得性感染的风险。此外，培养取样往往敏感性较低，这取决于培养基、特定的布鲁菌种类、疾病阶段和循环细菌的数量[8]。血清学试验似乎比血培养更有效，但由于来自布鲁菌病低流行率地区或亚临床流行率地区的样本存在交叉反应或亚敏感反应，结果可能不具有特异性。此外，在血清学上很难区分布鲁菌属[9]。组织病理学结果同样特异性不高，因为其结果可能类似于结核分枝杆菌[10]。多重PCR检测虽然有较高的灵敏性，但多重PCR仅局限于部分细菌的检测。

3.2 mNGS在诊断布鲁菌脊柱炎中的优势

本研究结果显示，敏感性和阴性预测值：mNGS均高于血培养、SAT和Giemsa染色(P<0.05),与多重PCR检测比较差异均无统计学意义(P>0.05)。mNGS诊断的优势：① mNGS检测结果范围涵盖了目前基因组序列已知的6 350种细菌、1 798种DNA病毒、1 064种真菌和 234 种寄生虫，基本纳入了所有脊柱感染病原微生物[11]。相对于多重PCR检测，mNGS除了能够进行耐药基因分析，还能鉴别布鲁菌与其他病原体导致的脊柱混合感染。② mNGS是一种不依赖于培养的诊断方法，其检测结果只取决于DNA文库建立时的致病微生物DNA含量；而且mNGS对病原微生物的鉴定受抗生素暴露影响小，即使病原微生物经抗感染治疗死亡，但短期内其DNA仍可保留活性，通过mNGS仍可获取结果[12,13]。③ 不同于消化液、脓液等其他感染样本，脊柱是天然无菌环境，因此当mNGS检出不止布鲁菌一种病原微生物时通常可明确混合感染的诊断。④ 人类布鲁菌病可与特定地理区域内动物布鲁菌病的状况直接相关，因此除了诊断布鲁菌病外，查明致病菌种属对提高流行病学知识、改善治疗和控制措施也有重要意义，mNGS可以鉴别布鲁菌种属[14]。⑤ mNGS检测效率高，高效快速的特点意味着可以为布鲁菌脊柱炎患者尽早制定治疗方案，从而降低病情加重的风险。

3.3 体会

① 由于椎体的上终板血供丰富，是布鲁菌进入人体后最先侵及的部位，然后再进一步侵及椎间盘和椎体，引起椎间盘炎和椎体炎[15]。本研究髓核中mNGS和多重PCR检测阳性率均高于静脉血、软骨终板、黄韧带和纤维环(P<0.05)。因此，对于怀疑布鲁菌脊柱炎的患者，术中应有针对性地清除并保留髓核组织标本，有助于提高诊断准确率。② 本研究中静脉血的mNGS、与多重PCR、SAT检测阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。SAT操作方便，结果回报时间相对较快，对于有脊柱受累但选择非手术治疗的患者，SAT可作为筛查布鲁菌脊柱炎的主要手段，而mNGS可能对诊断感染病原体不明确的布鲁菌脊柱炎更有价值。

综上所述，mNGS可以作为布鲁菌脊柱炎的有效检测手段，其敏感性和准确率高，尤其适用于术前无法明确诊断且术后病理结果为阴性但需确诊的患者，可为布鲁菌脊柱炎的精准治疗提供重要的病原学依据。

参考文献:

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[9]孙华丽,徐新民,蒋荣猛,等.人布鲁杆菌感染血清学检测及其临床应用价值[J/CD].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2018,12(2):114-119.

[14]彭珵.基于微分动力学方程的人布鲁氏菌病同动物疫情及干预措施关系的探索性研究[D].沈阳:中国医科大学,2020.

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文章来源:张文升,齐立明,张耀,等.宏基因组二代测序技术在布鲁菌脊柱炎诊治中的应用价值[J].临床骨科杂志,2024,27(02):284-288.