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静脉注射利多卡因后差异蛋白质的蛋白质组学分析

2024-06-25 47 上传者：管理员

摘要：目的利用蛋白质组学技术定量分析静脉注射利多卡因(IVL)前后血清中差异蛋白质的表达。方法选取健康志愿者5例，IVL 1.5 mg•kg-1后再以3 mg•(kg•h)-1持续泵注30 min。IVL前和IVL后1 h各采集静脉血5 mL，通过串联质谱标记及高效液相色谱分离技术鉴定IVL后差异表达蛋白，并采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)数据库分析鉴定差异蛋白的生物学信息。结果检测到IVL前后的血清中差异蛋白共15种，其中上调蛋白6种、下调蛋白9种。GO分析发现，大部分差异蛋白参与了细胞进程；亚细胞结构定位发现多数差异蛋白定位于细胞外区域及细胞质；功能富集分析发现多数蛋白参与炎性反应调节、B细胞的活化调控和蛋白质加工。上调蛋白组KEGG通路富集到p53信号通路。通过对上调组和下调组差异蛋白分析，发现差异蛋白依托泊苷诱导的2.4号蛋白(EI24)参与p53信号通路且调控钙离子浓度。结论 IVL可能通过调控依托泊苷诱导的EI24和上池蛋白(SBSN)抑制肿瘤细胞的发生与发展；EI24可能通过调控细胞内钙离子浓度参与IVL产生的镇静作用。

关键词：
串联质谱标签
利多卡因
基因本体论
富集分析
差异蛋白
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利多卡因是一种酰胺类局部麻醉药，主要用于局部麻醉和区域阻滞。早期静脉注射利多卡因（intravenous lidocaine,IVL）主要用于治疗心律失常[1]。近几年，临床研究显示，静脉注射利多卡因不仅可以镇痛镇静，还可以减轻术后恶心、呕吐症状，且具有抗肿瘤和抗炎作用[2,3,4,5,6]。因此，利多卡因作为一种辅助用药被广泛应用于全身麻醉的患者，其镇静镇痛作用和抗肿瘤作用也受到高度关注，成为近几年研究热点之一。但利多卡因的抗肿瘤、抗炎和镇静作用机制尚缺乏理论依据。因此，本研究使用串联质谱标签（tandem mass tag,TMT）的定量质谱技术，鉴定IVL前后静脉血中的差异表达蛋白，并寻找其与利多卡因的抗肿瘤、抗炎和镇静作用的潜在关系。

1、资料与方法

1.1研究对象

纳入志愿者5例，女性2例、男性3例。纳入标准：1）健康男性或女性，美国麻醉医师协会（ASA）分级为Ⅰ级；2）体质量指数（body mass index,BMI）为19～24 kg·m-2;3）年龄为20～44岁；4）签署知情同意书；5）禁食6 h。排除标准：1）对利多卡因过敏者；2）有打鼾或阻塞性睡眠呼吸暂停综合征病史者；3）静脉注射利多卡因后出现心律失常、呼吸困难或抽搐等症状者。本研究已获宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（编号：KYLL-2023-0291）。

1.2样品中全部蛋白的提取和还原烷基化

所有志愿者均采取平卧位，监测生命体征。在IVL前采集左侧肘静脉血5 mL。休息10 min后5名志愿者以1.5 mg·kg-1的剂量静脉推注利多卡因，随后以3 mg·（kg·h)-1持续泵注30 min。泵注结束1 h后采集静脉血5 mL。将标本保存于抗凝管中，然后设定离心机，于4℃下3 000×g离心15 min。离心后，收集血浆上清液，保存于-80℃冷冻柜。使用BCA kit测定蛋白浓度。每个样品中提取100μg蛋白。加入5 mmol·L-1二硫苏糖醇还原二硫键，在30℃下反应60 min。加入30 mmol·L-1碘乙酰胺阻断游离巯基，室温下避光反应45 min。随后将蛋白质沉淀，并用等体积的丙酮洗涤。

1.3多肽的胰蛋白酶消化和TMT标记

沉淀物用丙酮洗涤3次，悬浮于0.1 mol·L-1碳酸氢盐三乙基铵中，并用1/25胰蛋白酶溶液在37℃下消化12 h。用1%三氟乙酸终止，所得肽用Strata X C18固相萃取柱清洗，然后在ScanVacmax-beta(LaboGene）真空浓缩仪中真空干燥。冻干后，将标记的多肽再溶解，用A液重组。随后从每个样品中取50μg多肽混合，以20 000×g离心2 min。上清样品上载于C18柱上，在碱性条件下用常规高效液相色谱进行反梯度分离。根据紫外灯检测的峰范围，将洗脱的肽组分组合成12个组分，并进一步使用真空浓缩器进行干燥。

1.4高效液相色谱串联质谱（HLPC-MS/MS）分析

将各预分离组分溶解于体积为10μL的A液相中，以20 000×g离心2 min，将上清液转移至上样瓶。使用液质联用系统对每个组分进行1 h的液质联用分析，上样量约为2μg。

1.5生物信息学分析

首先，本研究蛋白组基因本体论（gene ontology,GO）注释从UniProt-GOA数据库（http：//www.ebi.ac.uk/GOA/）中获得。然后利用WoLF PSORT软件对所提交的蛋白进行亚细胞定位注释。最后利用京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库对通路进行注释，并进行GO富集分析与KEGG通路富集分析。

1.6统计学方法

以IVL前样本为对照组，IVL后样本为实验组。对数据库检索得到的所有蛋白进行分析，符合表达差异倍数在1.2倍以上（上下调）且P≤0.05筛选标准的蛋白视为差异表达蛋白。

2、结果

2.1 TMT分析差异表达蛋白

经蛋白质提取、酶解、TMT、标记、高效液相色谱分离等处理，共获得288 293个二级质谱图。随后通过检索数据库鉴定出3 911个匹配光谱。质谱分析鉴定出1 499个多肽，其中包括1 474个独特多肽。此外，本研究共鉴定出504种蛋白，其中397种可定量。定量分析时，根据标记试剂在质谱仪中的信号强度计算出每个样品的相对定量值。采用实验设计比较方案，确定实验组与对照组的相对蛋白表达量。最终鉴定出15种差异表达蛋白，其中下调蛋白9种、上调蛋白6种，见表1、表2。

2.2差异表达蛋白的功能分类

GO二级注释中差异表达蛋白的分布结果显示，14种蛋白参与细胞过程、11种蛋白参与对刺激的反应、10种蛋白参与生物调控、8种蛋白参与代谢过程。在细胞组成中，IVL后产生的差异表达蛋白中有15种蛋白质被归类为细胞解剖实体，3种被归类为含蛋白质复合体。分子功能中，有11种蛋白表现出结合作用，4种蛋白表现出催化作用等，见图1。采用WoLF PSORT软件对所提交的蛋白进行亚细胞定位预测和分类统计，结果显示，大多数差异表达蛋白定位在细胞外区域（40.91%），其次是细胞质（31.82%）和质膜（13.64%），见图2。

表1表达为上调的6种差异蛋白

表2表达为下调的9种差异蛋白

2.3差异表达蛋白的功能富集

通过GO分类、KEGG通路富集分析检测差异蛋白，并获得富集趋势。结果显示，差异表达蛋白的功能富集在分子功能方面未发现显著富集趋势，见图3。

3、讨论

近年来，随着临床实践的推进，越来越多的研究[7,8]证明，IVL可以产生很多非局部麻醉作用。除其已明确的钠离子通道阻滞作用，IVL还可以使肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α）诱导的H838肺癌细胞中原癌基因酪氨酸蛋白激酶活化和细胞间黏附分子1磷酸化程度降低，从而阻断TNF-α诱导的肺癌细胞侵袭性的增加[9]。利多卡因还可以逆转围手术期应激、疼痛、阿片类药物等导致的自然杀伤（natural killer,NK）细胞活性降低，进而调控肿瘤细胞的识别与杀伤[1]。也有研究[10]表明，利多卡因镇痛机制与γ-氨基丁酸受体、α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体和N-甲基-D-天冬氨酸受体有关。关于利多卡因的镇静作用，主要通过观察异丙酚与利多卡因联用是否减少了所需的异丙酚的剂量[11]。

目前，有关IVL后对血液中差异蛋白进行定量的蛋白质组学分析鲜见报道。本研究通过使用TMT，共鉴定出504种蛋白质，其中15种蛋白质在IVL后存在差异调节。通过GO注释、富集分析发现，多数差异表达蛋白主要参与了生物过程，在体内执行某一特定功能。此外，本研究对差异蛋白进行KEGG通路富集分析，获得了p53信号通路。在肿瘤发生和发展的过程中，多种基因参与了肿瘤的调控。已知依托泊苷诱导的2.4号蛋白（etoposide-induced protein 2.4,EI24）是一种由依托泊苷以依赖于p53的方式诱导的DNA损伤应答基因，可通过p53介导的凋亡途径抑制细胞生长，因此在多种恶性肿瘤中通过促进癌细胞凋亡发挥抑癌作用。EI24基因编码的位于内质网膜上的EI24蛋白，与应激适应和钙稳态有关，参与自噬小体的形成，促进自噬通量，从而在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用。而p53信号通路是细胞生存与死亡调控的重要通路。EI24通过协调钙稳态来保护细胞免受内质网应激诱导的细胞凋亡[12]。目前已有研究[13]证实，EI24在上皮型肿瘤细胞中高表达，则会抑制上皮间质转化引起的细胞移动性、侵袭性的增加。同时，EI24在胰腺癌、直肠癌等癌症发生发展过程中也起着至关重要的作用[14,15]。在本研究中，IVL后血中EI24具有显著差异，差异倍数为5.281，证明注射利多卡因后能显著提高EI24水平。同时，实验结果提示，IVL后血中上池蛋白（suprabasin,SBSN）水平显著下调，差异倍数为0.395。已知SBSN过表达出现在各种癌症中，通常参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和血管生成[16]，由此可见，IVL可能通过调控EI24和SBSN这两种蛋白在血浆中的浓度从而抑制肿瘤细胞的形成。有研究[12]表明，EI24通过协调钙稳态来保护细胞免受内质网应激诱导的细胞凋亡。此外，EI24与肌浆/内质网Ca2+ATP酶2(Sarco/endoplasmic reticulum calcium AT-Pase2,SERCA2）活性调控有关。SERCA2是一种p型离子驱动的ATP酶，每水解一个ATP分子就会将两个Ca2+离子从细胞质运送到管腔。同时，SERCA2在稳定大脑神经元内的钙离子中起着重要作用，并影响内质网钙稳态的稳定性[17]。在缺乏EI24的情况下，会导致SERCA2活性降低，并与内质网Ca2+消耗和细胞内游离Ca2+升高有关[18]。最终，引起神经元内钙稳态的变化。结合GO分析、亚细胞结构定位以及KEGG富集分析，推测IVL后的镇静作用可能通过p53信号通路升高EI24浓度，并导致SERCA2活性增强，从而引起中枢神经细胞内Ca2+浓度下降，进而引起神经细胞内钙稳态变化。然而，此变化与镇静作用之间的联系仍需进一步验证。本研究中，未能发现与利多卡因抗炎相关蛋白。

图1 GO二级注释分类

横轴代表参与不同GO分类的差异蛋白数量，纵轴为GO不同分类。

图2亚细胞结构定位与分类统计

图3差异蛋白功能富集分析

综上所述，本研究通过对上调和下调差异蛋白的分析，发现IVL后的抗肿瘤作用可能与血浆EI24水平升高、血浆SBSN水平下调，从而抑制肿瘤细胞增殖和侵袭相关。此外，本研究通过EI24调控细胞内钙离子的浓度，为探究利多卡因的镇静作用机制提供了新的研究方向。

参考文献:

[7]静广建,刘照国,于飞,等.体外循环期间应用利多卡因对心脏瓣膜置换术后患者谵妄的影响[J].实用医学杂志,2022,38(13):1637-1641.

[8]李亚星,高晓宁,孙艳斌.不同剂量利多卡因对老年患者腹腔镜下结肠癌根治术后早期恢复质量的影响[J].临床麻醉学杂志,2023,39(8):811-815.

基金资助:宁夏自然科学基金项目(2021AAC03341);

文章来源:李翔,张永海,杨凡,等.静脉注射利多卡因后差异蛋白质的蛋白质组学分析[J].宁夏医科大学学报,2024,46(06):571-576.