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饱和氢气红细胞保存液对红细胞保存损伤的影响及机制

2020-10-12 255 上传者：管理员

摘要：目的探讨饱和氢气红细胞保存液对红细胞保存损伤的影响及可能机制,为提高红细胞保存质量提供新思路。方法12例健康成年志愿者随机分为饱和氢气组和对照组各6例,2组均采全血50mL,饱和氢气组加入饱和氢气CAD红细胞保存液,对照组加入CAD红细胞保存液,得到浓缩红细胞悬液。分别于红细胞悬液制备后的第1、10、20、30天检测2组红细胞悬液中红细胞压积(hematocrit,HCT)、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性、谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性以及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、红细胞膜巯基含量和丙二醛含量。结果第1天时,2组红细胞悬液HCT、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、GSH活性以及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基和细胞膜MDA含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。随着红细胞保存时间延长,2组红细胞悬液HCT、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、GSH活性、Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基含量逐渐降低(P<0.05),K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度、细胞膜MDA含量逐渐增高(P<0.05);第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞悬液HCT、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、GSH活性以及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基含量明显高于对照组(P<0.05),K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度和细胞膜MDA含量明显低于对照组(P<0.05)。结论饱和氢气红细胞保存液可减轻红细胞的保存损伤,可能与饱和氢气红细胞保存液抑制红细胞保存过程中的氧化损伤有关。

关键词：
临床内科
氧化反应
红细胞
红细胞保存液
细胞膜MDA
饱和氢气
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输注红细胞是临床贫血、创伤患者重要的救治方法[1]。随着红细胞保存时间的延长,不可避免发生保存损伤[2]。输注损伤的红细胞不仅引起微循环紊乱、抑制受体免疫功能,还可诱发全身炎性反应[3]。储存红细胞内的氧化反应是保存损伤的始动因素[4,5]。因此,减少储存红细胞内氧化反应,对减轻红细胞保存损伤,改善红细胞输注患者预后有重要意义[6]。氢气作为一种抗氧化剂被证实具有抗氧化、抗感染、抗肿瘤及防止辐射损伤等生物学效应[7,8]。本研究探讨饱和氢气红细胞保存液对红细胞保存损伤的影响及机制,为提高红细胞保存质量提供新思路,报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2019年4—5月河南省人民医院选取的健康成年志愿者12例,男6例,女6例;年龄18～40岁;体质量指数18～24kg/m2。入选者血常规各项指标未见异常,既往无输血史。随机分为饱和氢气组和对照组各6例。

1.2方法

1.2.1实验方法

2组均采全血50mL,离心半径13.5cm,3000r/min离心10min,对照组离心后的红细胞加入CAD红细胞保存液制成浓缩红细胞悬液,饱和氢气组离心后的红细胞加入饱和氢气CAD红细胞保存液制成浓缩红细胞悬液(在0.40MPa压力下,将氢气溶于红细胞保存液8h以达到饱和状态,使用气相色谱分析仪检测氢浓度>0.6mmol/L,即将纯氢充入含有红细胞保存液的储血袋内至涨满,然后将其放入铝箔内,放入0.4kPa高压舱压8h)。氢气由武汉市好运气贸易有限公司提供(制备技术已获国家专利,专利号ZL102557227B)。

1.2.2红细胞悬液红细胞压积(hematocrit,HCT)、K+浓度、游离血红蛋白、红细胞溶血率检测

2组分别取抗凝血0.5mL加入压积管中,应用XT-2000isysmex全自动血球仪(希森美康无锡科技有限公司)测定HCT。2组分别采集混匀红细胞悬液1mL,应用EasyLyteplus电解质分析仪(麦迪卡医疗设备有限公司)测定K+含量。2组分别采集混匀红细胞悬液1mL,应用微量游离血红蛋白测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血浆游离血红蛋白含量。红细胞溶血率的测定按全国临床检验操作规程进行,红细胞溶血率=游离血红蛋白(g/L)×(1—HCT)×100%/总血红蛋白(g/L)。

1.2.3红细胞悬液超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性检测

应用SOD测试试剂盒、CAT测试盒、GSH和GSH-Px测试试剂盒(南京建成生物工程研究所),采用黄嘌呤氧化酶法测定红细胞SOD活性,采用钼酸铵比色法检测红细胞CAT活性;并计算GSH和GSH-Px活性。

1.2.4红细胞膜制备

在无菌操作台内取红细胞悬液2mL,离心半径13.5cm,3000r/min离心10min弃上清液,以1:3加入等渗pH7.4PBS,离心半径13.5cm,3000r/min离心10min,弃上清液,反复洗涤3次,最终得到干净红细胞。按照1:80向红细胞中加入预冷5mmol/LpH7.4Tris-HCL溶液,同时加0.1mmol/L蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟,超声15min(80Hz,20℃),放入4℃冰箱过夜使其充分溶血。红细胞溶血液以离心半径13.5cm,15000r/min离心10min,弃上清液,加入5mmol/LpH7.4Tris-HCL溶液以离心半径13.5cm15000r/min离心10min,反复洗涤3次,最后得到乳白色膜,将其1:1悬浮在PBS溶液中,膜蛋白定量后置于低温冰箱备用。

1.2.5红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、丙二醛含量和总巯基含量检测

采用Na+-K+-ATP酶试剂盒、细胞MDA测定试剂盒、总巯基(-SH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、红细胞膜MDA含量和红细胞膜巯基含量。

1.3观察指标

分别于红细胞悬液制备后的第1、10、20、30天检测2组红细胞悬液HCT、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、GSH活性以及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、红细胞膜巯基含量和MDA含量,并进行2组间比较。

1.4统计学处理

应用SPSS18.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,2组比较采用t检验,不同时间点比较采用重复测量方差分析;计数资料比较采用χ2检验;检验水准α=0.05。

2、结果

2.12组红细胞悬液HCT、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度比较

红细胞悬液制备后第1天,2组红细胞悬液HCT、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。随着红细胞保存时间延长,2组红细胞悬液HCT逐渐下降,K+浓度、红细胞溶血率和游离血红蛋白浓度逐渐增高(P<0.05);第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞悬液HCT明显高于对照组(P<0.05),K+浓度、红细胞溶血率和游离血红蛋白浓度明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表12组红细胞悬液HCT、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度比较(x¯±s)

注:HCT:F组间=195.30,P<0.001;F时间=22.58,P<0.001;F交互=5.87,P=0.002。K+:F组间=1482.00,P<0.001;F时间=94.89,P<0.001;F交互=13.27,P<0.001。红细胞溶血率:F组间=1256.00,P<0.001;F时间=40.79,P=0.005;F交互=9.43,P=0.001。游离血红蛋白:F组间=1930.00,P<0.001;F时间=16.35,P=0.003;F交互=6.02,P=0.002。a与本组第1天比较,P<0.05;b与本组第10天比较,P<0.05;c与本组第20天比较,P<0.05;d与对照组同时间点比较,P<0.05。

2.22组红细胞悬液SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性比较

红细胞悬液制备后第1天,2组红细胞悬液SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性比较差异均无统计学意义(P>0.05)。随红细胞保存时间延长,2组红细胞悬液SOD、CAT、GSH-Px和GSH活性均逐渐降低(P<0.05)。第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞悬液SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表22组红细胞悬液SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性比较(x¯±s)

注:SOD活性:F组间=298.90,P<0.001;F时间=45.77,P<0.001;F交互=2.96,P=0.043。CAT活性:F组间=735.90,P<0.001;F时间=12.40,P=0.003;F交互=7.86,P=0.004。GSH-Px活性:F组间=460.10,P<0.001;F时间=8.19,P=0.002;F交互=6.04,P=0.025。GSH活性:F组间=587.10,P<0.001;F时间=73.01,P<0.001;F交互=10.42,P<0.001。a与本组第1天比较,P<0.05;b与本组第10天比较,P<0.05;c与本组第20天比较,P<0.05;d与对照组同时间点比较,P<0.05。

2.32组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基、细胞膜MDA含量比较

红细胞悬液制备后第1天,2组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基和细胞膜MDA含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。随红细胞保存时间延长,2组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基含量逐渐降低(P<0.05),细胞膜MDA含量逐渐升高(P<0.05)。第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基含量明显高于对照组(P<0.05),细胞膜MDA含量明显低于对照组(P<0.05)。见表3。

表32组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基、细胞膜MDA含量比较(x¯±s)

注:Na+-K+-ATP酶活性:F组间=275.60,P<0.001;F时间=32.55,P<0.001;F交互=3.35,P=0.028。细胞膜巯基:F组间=512.70,P<0.001;F时间=56.69,P<0.001;F交互=10.18,P<0.001。细胞膜MDA:F组间=339.10,P<0.001;F时间=11.35,P=0.015;F交互=2.23,P=0.043。a与本组第1天比较,P<0.05;b与本组第10天比较,P<0.05;c与本组第20天比较,P<0.05;d与对照组同时间点比较,P<0.05。

3、讨论

红细胞保存过程中出现的红细胞保存损伤可能是输血相关并发症(皮疹/荨麻疹、发热反应、过敏反应、血管内溶血、输注相关性肺损伤等)的主要原因,但储存红细胞内的氧化反应可能是保存损伤的始动因素。因此,对红细胞保存液进行处理,添加可抑制氧化反应的有效成分,减轻储存红细胞氧化反应,对缓解红细胞保存损伤,改善输注红细胞患者的预后有重要意义[9]。氢气作为一种特异性抗氧化剂已广泛用于多种与氧化损伤相关疾病的研究,目前认为氢气主要通过特异性中和体内毒性自由基而发挥抗氧化作用[7],而红细胞体外保存过程中质量降低的重要原因是氧化损伤。

在储存早期,红细胞可由盘形变为球形,继而出现膜脂质和蛋白的丢失以及结构蛋白的改变,最早期的形态变化与Na+-K+-ATP酶减少有关,并可因Na+-K+-ATP酶含量的恢复而逆转,但红细胞严重变形是不可逆的,并与输注后红细胞生存能力的降低有关。本研究结果显示,红细胞悬液制备后第1天,2组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基和MDA含量比较差异无统计学意义;而第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、细胞膜巯基含量高于对照组,MDA含量低于对照组;说明随着红细胞保存时间的延长,Na+-K+-ATP酶活性逐步降低,细胞膜巯基含量逐渐降低,细胞膜MDA含量逐渐升高,红细胞对能量利用能力明显下降,代谢产物大量堆积,可导致细胞形态变化及细胞内外Na+、K+等离子浓度差失衡而发生溶血[2]。本研究结果显示,红细胞悬液制备后第1天,2组红细胞悬液HCT、K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度比较差异无统计学意义;随着红细胞保存时间的延长,2组红细胞悬液HCT逐渐降低,K+浓度、红细胞溶血率、游离血红蛋白浓度逐渐增高;说明红细胞在储存过程中出现了明显保存损伤。第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞悬液HCT明显高于对照组,K+浓度、红细胞溶血率和游离血红蛋白浓度明显低于对照组;说明保存液中加入氢气有助于减轻红细胞保存过程中出现的保存损伤。

SOD、CAT、GSH-Px及GSH是机体重要的抗氧化系统[10],SOD在清除超氧阴离子和亚硝酸盐形成中起重要作用,是一种重要的抗氧化酶,CAT具有将过氧化氢转化为水和氧的功能,是另一种重要的抗氧化酶,其在机体拮抗氧化应激损伤和清除自由基的过程中发挥重要作用[11,12]。Zhou等[13]动物研究证实,吸入氢气可通过降低MDA水平、上调SOD水平以预防自由基介导的损伤,从而减弱氧化应激减轻肺移植损伤。本研究结果显示,红细胞悬液制备后第1天,2组红细胞悬液中抗氧化损伤的酶系SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性比较差异无统计学意义,随红细胞保存时间延长,2组红细胞悬液中抗氧化损伤的酶系SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性逐渐降低;说明红细胞储存过程中的保存损伤可能与红细胞内出现的过度氧化反应有关。第10、20、30天时,饱和氢气组红细胞悬液SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性明显高于对照组;说明红细胞保存液中加入氢气后,抗氧化损伤的酶系SOD、CAT、GSH-Px、GSH活性明显增高;提示氢气可改善红细胞保存损伤,可能与保存液中加入氢气后提高了抗氧化酶系的活性有关。

本研究结果提示,将氢气采用高压的方式融入红细胞保存液中,与红细胞混合制备成红细胞悬浮液,可明显提高红细胞的保存质量,其机制可能与氢气减轻红细胞保存过程中的氧化损伤有关。

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基金:河南省科技厅科技攻关项目(172102310101).