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肝郁脾虚型功能性消化不良大鼠胃及下丘脑BDNF在胃痛消痞方下的影响实验观察分析

2020-07-21 243 上传者：管理员

摘要：目的观察胃痛消痞方对肝郁脾虚型功能性消化不良(FD)大鼠脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的影响。方法选用改良郭氏夹尾刺激法联合张氏不规则喂食法复制FD大鼠模型,以西药莫沙必利片为阳性对照,中药干预以胃痛消痞方灌胃治疗。实验结束后,观察各组大鼠的一般状态,免疫组化法(IHC)观察胃窦及下丘脑组织BDNF蛋白表达,实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time,RT-PCR)观察胃窦及下丘脑组织中BDNF mRNA的变化,蛋白印记(Western blot,WB)法检测各组大鼠胃窦及下丘脑组织中BDNF蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠胃窦及下丘脑组织中BDNF表达(IHC)、BDNF mRNA相对表达量(RT-PCR)、BDNF蛋白表达(WB)均降低(P<0.05);与模型组比较,中药组和西药组大鼠胃窦及下丘脑组织中BDNF表达(IHC)、BDNF相对表达量(RT-PCR)、BDNF蛋白表达(WB)均增高(P<0.05);与西药组比较,中药组BDNF表达效果(IHC)更好(P>0.05),BDNF mRNA相对表达量(RT-PCR)效果更好(P<0.05),BDNF蛋白表达量(WB)增加明显,效果更好(P<0.05)。结论胃痛消痞方对FD大鼠的胃窦、下丘脑组织BDNF表达有明显改善,并可有效调节胃窦、下丘脑组织中BDNF基因及蛋白表达,胃痛消痞方对肝郁脾虚型FD的治疗作用可能是通过改善BDNF水平实现的。

关键词：
BDNF
FD 发病机制
临床常见疾病
功能性消化不良
胃痛消痞方
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功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是临床常见疾病[1],因其发病机制和病因的不确定性,FD的治疗方法也多种多样,包括根除幽门螺杆菌、抑酸保护胃黏膜、促进胃肠动力及给予抗抑郁/焦虑药,然而,尚未发现切实有效的方法。在诸多治病因素中,胃肠动力障碍与精神情绪障碍被认为是FD发病的重要因素。已有研究证实, FD发病机制可能与脑肠轴(Brain-gut axis,BGA)功能的异常密切相关[2,3]。而FD是中医治疗的优势病种之一,随着最新的罗马Ⅳ标准将草药纳入FD的治疗方案中[4],现代中医针对FD的研究更加深入、广泛。胃痛消痞方临床疗效显著,前期部分作用机制已被研究证实[5,6,7,8,9,10]。本实验以脑肠轴及脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)为切入点,检测大鼠胃与下丘脑BDNF、BDNF mRNA,探讨胃痛消痞方治疗肝郁脾虚型FD可能的机制,为胃痛消痞方的临床应用提供理论依据及实验依据。

1、材料和方法

1.1试验药物

枸橼酸莫沙必利片:购自亚宝药业集团股份有限公司,批号:H20090158。依据人与大鼠体表面积换算公式,得出大鼠等效剂量为1.575 g/(kg·d),用蒸馏水配制成溶液,储存于4℃冰箱中。

胃痛消痞方颗粒剂:党参10 g、柴胡12 g、白芍20 g、延胡索20 g、白术20 g、砂仁15 g、枳实12 g、炒麦芽20 g、炙甘草6 g、焦山楂10 g、鸡内金10 g,由中国医科大学附属盛京医院中药房提供(北京康仁堂药物有限公司)。依据人与大鼠体表面积换算公式,得出大鼠等效剂量为16.275 g/(kg·d),按照比例配制成溶液,储存于4℃冰箱中。

1.2动物

健康SD雄性大鼠48只(北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2014-0004),SPF级,体重250～280 g。

1.3试剂

全蛋白提取试剂盒(货号:WLA019)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:WLA004)、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒(货号:WLA013)、Super M-MLV反转录酶(货号:PR6502)、高纯总RNA快速提取试剂盒(货号:RP1201,BioTeke·中国)。

1.4主要仪器

水平摇床、微量移液器、超纯水系统、电泳仪、转移槽、双垂直蛋白电泳仪、凝胶成像系统、超速冷冻离心机、酶标仪、电热恒温培养箱、超纯水系统、超速冷冻离心机、微量移液器、真空干燥箱、紫外分光光度计、荧光定量PCR仪等。

1.5方法

(1)模型建立:将48只健康SD大鼠饲养于SPF级动物屏障中,室温为(20±2)℃,湿度为(50%±10%),按照标准适应性喂养3 d后开始实验。按照空白对照组、模型对照组、胃痛消痞方组、莫沙必利组,将48只SD大鼠随机分配,每组12只。利用改良郭氏夹尾刺激法联合张氏不规则喂食法,用纱布将长海绵钳头部包裹后,连续不断地夹大鼠尾巴末端1/3处,以此激怒大鼠使其互相厮打,考虑大鼠之间互相厮打可能会造成不同程度的抓伤,为避免伤口感染,准备0.5%碘伏用无菌棉签沾取涂擦受伤部位,以控制感染,每次刺激持续30 min,每12小时进行1次;同时单双日不规则喂食,连续刺激21 d。造模结束后,观察大鼠一般状态,若其出现食欲不振、体重减轻、大便稀溏臭秽、毛发枯黄且干燥、喜静恶动、烦躁易怒、精神焦虑等表现,则提示造模成功。(2)分组给药:造模结束后剔除每组因未知原因死亡大鼠后,每组剩余9只大鼠。按照分组分别进行灌胃给药,空白对照组及模型对照组每只大鼠予生理盐水2 ml,胃痛消痞方组每只大鼠予颗粒剂溶液16.275 g/(kg·d),莫沙必利组每只予莫沙必利片溶液1.575 g/(kg·d),每组早晚两次进行灌胃给药,持续给药21 d。(3)取材:4组大鼠断头处死,打开腹腔,取出胃,切取胃窦部分放入1.5 ml灭菌的冻存管中,放入液氮瓶中迅速冷冻后放入-80℃冰箱中保存备用。再将脑组织从大鼠颅内剥离后放置于干冰上,用医用灭菌刀片分离脑组织,取出下丘脑部分放入1.5 ml灭菌的冻存管中,放入液氮瓶中迅速冷冻后放入-80℃冰箱中保存备用。

1.6指标检测

(1)行为学观察:观察各组大鼠进食量、饮水量、毛发的颜色与光泽、大小便的性状、体重、每日的活动度及反应等大体指标。(2)应用IHC法:切片脱蜡水化,消除内源性过氧化物酶活性,抗原修复,降低非特异性,一抗孵育,复温,二抗孵育,显色,脱水,透明,封片,阴性对照,阳性细胞计数,染色强度分析,采用Image-Pro Plus 6.0,Media Cybernetics系统,400倍光镜下每张切片随机5个视野,测定光密度值和整合光密度值。(3)应用RT-PCR法检测:将胃窦组织及下丘脑组织从-80℃冰箱取出,依次进行总RNA提取,反转录,实时荧光定量分析。本实验利用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。(4)利用WB检测:将胃窦组织及下丘脑组织从-80℃冰箱取出,依次进行蛋白质抽提,蛋白质定量,SDS-PAGE,转印,封闭,孵育一抗,孵育二抗,ECL底物发光,抗体剥脱,封闭,孵育内参抗体,孵育二抗,ECL底物发光,结果分析,将胶片进行扫描,用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

1.7统计学方法

实验数据全部输入Excel工作表,计量资料以SPSS 26.0软件进行数据处理,以均数±标准差(x¯±s)来表示,满足正态性时采用单因素方差分析,组间比较方差齐时采用方差分析LSD检验,若方差不齐则用方差分析t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1一般情况

造模后,空白组大鼠仍皮毛光泽,精神状态佳,活动度好,饮水量及进食量正常,体重增加,肌肉结实,二便正常,全程无死亡;各造模组大鼠均出现毛色光泽度差、精神萎靡活动度差、进食量及饮水量减少、体重增加缓慢或减少等现象。治疗3周之后,模型组大鼠一般情况及行为表现仍然不佳,中药组及西药组上述情况均有不同程度的好转,且无明显差异。实验过程中共死亡8只大鼠。

2.2 IHC法检测各组大鼠胃窦、下丘脑BDNF。

见图1、图2及表1。

图1胃痛消痞方对各组大鼠胃窦组织BDNF免疫组化染色的影响(200×)

图2胃痛消痞方对各组大鼠下丘脑组织BDNF免疫组化染色的影响(200×)

表1各组大鼠胃窦、下丘脑BDNF蛋白比较

表1结果显示,与空白组比较,模型组大鼠BDNF表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,中药组和西药组大鼠BDNF表达明显增高(P<0.05),且中药组较西药组效果更好,但差异没有统计学意义(P>0.05)。

2.3利用蛋白印迹法分析检测大鼠胃窦与下丘脑BDNF表达

见表2。

表2各组大鼠胃窦、下丘脑组织BDNF蛋白表达比较

表2结果显示,与空白组相比较,模型组大鼠胃窦及下丘脑组织BDNF mRNA相对表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,用药组大鼠胃窦及下丘脑组织BDNF mRNA相对表达量均明显增加(P<0.05);中药组大鼠胃窦及下丘脑组织BDNF mRNA相对表达量较西药组增加明显(P<0.05)。

2.4 RT-PCR法分别检测大鼠胃窦与下丘脑BDNFmRNA表达

与空白组相比较,模型组大鼠胃窦及下丘脑组织BDNF mRNA相对表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,中药组及西药组大鼠胃窦及下丘脑组织BDNF mRNA相对表达量均明显增加(P<0.05);中药组大鼠胃窦组织BDNF mRNA相对表达量较西药组增加明显(P<0.05)。见表3。

表3胃痛消痞方对各组大鼠胃窦及下丘脑组织BDNF mRNA表达比较

3、讨论

FD是临床上最常见的消化系统疾病之一,有报道对既往100项临床研究,总计312 415例病例进行分析发现,FD总患病率为21%[11]。FD作为临床最常见的身心障碍之一,临床症状以上腹痛、烧灼感、早饱等为主要表现,但这些症状难以用器质性疾病所解释。到目前为止,所发现的FD的发病因素众多且复杂多变,一般多认为本病同胃肠动力障碍、内脏高敏感、幽门螺杆菌感染、脑肠轴异常、饮食、生活、精神心理因素以及遗传等都密切相关[12]。现阶段认为,FD与精神心理障碍的共病率高,脑肠轴的调节障碍是FD与精神心理因素相互作用的关键所在。越来越多的研究表明,脑-肠轴异常在FD的发病机制中占有重要地位[13]。

中国古代医家认为,引起胃脘痛的原因甚多,但主要由食、寒、气所致,气滞是最基本的病机。“肝郁脾虚”是发病的基础和前提,“疏肝解郁,调节情志”是本病的根本治疗大法。胃痛消痞方由《太平惠民和剂局方》中四君子汤加减而成,是陈苏宁教授在多年的临床经验中总结而出。胃痛消痞方由党参、柴胡、白芍、延胡索、白术、砂仁、枳实、炒麦芽、炙甘草、焦山楂、鸡内金组成。方中柴胡、白芍、枳实疏肝;党参、白术、甘草健脾益气;延胡索、砂仁行气;焦山楂、鸡内金、炒麦芽消食。纵观全方,组方科学、配伍严谨,诸药合用,切中病机。

BDNF是维持神经元兴奋性及可塑性的重要调节因子,主要分布于中枢神经系统[14]。BDNF与疼痛、抑郁以及外界压力相关:一方面,BDNF具有疼痛敏感性,BDNF升高则可能与灼痛、胀痛等多种不适感有关[15];同时,BDNF的表达变化导致海马神经元可塑性和细胞再生能力的损伤,最终引起抑郁情感障碍,这是BDNF基因对抑郁的直接效应。BDNF在FD治疗中的主要作用体现在与内脏高敏感性相关以及调节胃肠道动力两个方面。Delafoy等[16]研究发现,向腹腔内注射抗BDNF抗体可降低FD模型大鼠结肠高敏感性,但对健康大鼠的内脏感觉阈值无明显作用。且在此过程中,尚有不同BGP参与其中,其通过抗CGRP抗体、抗NGF抗体调整内脏高敏性作用。BDNF不仅直接作用于感觉神经系统、同时与CGRP、NGF等BGP因子存在相互作用被证实。

本研究发现,造模组大鼠一般状态差,胃窦及下丘脑组织中BDNF表达、BDNF mRNA相对表达量、BDNF蛋白表达均降低;经治疗后,中药组及西药组大鼠胃窦组织中BDNF上述表达明显升高。本研究结果证明,胃痛消痞方对肝郁脾虚型FD大鼠有较好的治疗作用,BDNF可能是胃痛消痞方治疗FD的靶点之一;同时也为胃痛消痞方的临床应用及今后进一步研究提供了重要依据。

参考文献：

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范梦男,张博,陈苏宁.胃痛消痞方对肝郁脾虚型功能性消化不良大鼠胃及下丘脑BDNF影响的实验研究[J].实用药物与临床,2020,23(07):589-593.

基金:辽宁省自然基金资助项目(201602814).