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研究双酚A对小鼠睾丸间质细胞的毒性作用与miR-203-3p及PI3K/AKT/FOXO1信号通路的影响

2020-07-21 274 上传者：管理员

摘要：目的研究双酚A对小鼠睾丸间质细胞的毒性作用,及对miR-203-3p和PI3K/AKT/FOXO1信号通路的影响。方法不同浓度BPA(0、2、10、50、250μmol/L)处理小鼠睾丸间质细胞24 h,CCK8法检测细胞活力,Real time PCR检测miR-203-3p和FOXO1、AKT、PI3K的相对表达水平。结果不同浓度BPA处理细胞后,细胞活力随BPA剂量的增大而减少,50、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。各处理组miR-203-3p表达量均较对照组升高,10、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2、10μmol/L组FOXO1表达量较对照组升高,50、250μmol/L组表达量较对照组降低,2、50、250μmol/L组FOXO1相对表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。各处理组AKT水平均出现下降趋势,10、50、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。各处理组PI3K水平均出现下降趋势,50、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。结论双酚A致睾丸间质细胞损伤,影响miR-203-3p和FOXO信号通路相关基因的改变。

关键词：
化学单体
双酚A
微小RNA
睾丸间质细胞
细胞损伤
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双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种化学单体,广泛用于食品容器和个人物品的硬塑料生产。由于工业控制和处理不当,BPA已成为一种普遍存在的环境污染物,毒理学研究表明,BPA具有很强的外源性内分泌干扰物活性[1]。一项调查显示,BPA的需求预计到2019年将增长至近19亿美元[2]。在亚洲,特别是在中国,BPA的生产和消费每年都在急剧增加[3]。毒理学研究表明,BPA具有雌激素活性,可以破坏动物和人类的生理功能,特别是在生殖和内分泌系统中[4,5,6]。由于其具有弱雌激素样和强抗雄激素样作用,因此,对生殖系统的影响更加引起人们的关注。

研究表明,表观遗传改变在男性生殖系统疾病中起重要作用[7]。microRNAs(miRNAs)是一种小的非编码RNA分子,与转录后基因表达调控有关,miRNAs与具有互补序列的信使RNA(MRNAs)结合并抑制它们的翻译,抑制特定蛋白质的产生[8]。近年来,人们发现miRNA在哺乳动物的生殖调控中有着广泛的作用[9]。有研究表明,miRNA对男性精子形成过程中均有影响[10],在前期体内实验中发现,BPA暴露导致miR-203-3p的表达水平发生变化,且与FOXO信号通路有联系[11]。叉头盒O(Forkhead transcription factors,FOXO)是叉头转录因子家族的一个亚家族,在细胞命运决定中起重要作用,包括细胞增殖、存活、应激反应、代谢、长寿等过程[12]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/丝苏氨酸激酶(Serine threonine kinase,AKT)信号通路参与许多生物过程,例如:细胞周期、细胞生长、细胞代谢等[13]。FOXO1是FOXO的亚家族成员之一,在哺乳动物体内广泛存在,是PI3K/AKT信号通路的直接下游分子,当PI3K/AKT被激活,FOXO1发生磷酸化,从而发挥作用[14]。早在1850年,睾丸间质细胞(Testicular leydig cells,TM3)就有描述。1903年,有研究显示,TM3作为男性性分化所必需的激素生成细胞,能合成分泌雄性激素,可促进精子的发生和男性生殖器官发育,以及维持第二性征和性功能[15]。本文通过BPA处理TM3细胞后,对细胞活力、miR-203-3p相对表达量及与PI3K/AKT/FOXO1信号通路相关基因的检测,以证明BPA对睾丸间质细胞毒性、miR-203-3p及PI3K/AKT/FOXO1信号通路的影响,并为今后的BPA对雄性生殖毒性机制研究提供线索。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

小鼠TM3细胞购自中国科学院细胞库。

1.1.2仪器与试剂

CO2培养箱(INFORS,瑞士),超净工作台(北京东联哈尔仪器制造公司,中国),倒置显微镜(北京新惠泽奥科技有限公司,中国),Nano Drop核酸分析仪、台式离心机(Thermo,美国),酶标仪(Molecular Device,美国),达尔伯克氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(Dulbecco′s modified eagle medium/Nutrient mixture F-12,DMEM-F12)(Hyclone,美国);胎牛血清(Hyclone,美国);青霉素-链霉素(Biological iudustries,美国);二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(Sigma,美国),Vi-cell细胞活力计数仪(Beckman,美国),7500 Fast实时荧光定量PCR仪(Polymerase chain reaction,PCR)(ABI,美国),BPA(东京化成株式会社,质量分数>99%,日本),CCK-8细胞活力检测试剂(诺唯赞,中国),Trizol(生工生物,中国),miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA kit、miRcute Plus miRNA qPCR kit(天根,中国),cDNA逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa,日本)。

1.2方法

1.2.1 TM3细胞培养及处理

TM3细胞培养于10%胎牛血清、1%双抗(100 U/ml青霉素-100μg/ml链霉素)的DMEM-F12培养基中,于37℃、5%CO2(体积分数)的培养箱中培养,待细胞铺满瓶底80%左右进行传代,传至3代后分别用不同浓度的BPA(0、2、10、50、250μmol/L)处理TM3细胞24 h,对照组用含0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。

1.2.2 TM3细胞活力检测

用Vi-cell进行细胞计数,将细胞密度稀释至1.5×104/ml,以200μl/孔种于96孔板中。正常培养液培养24 h后,使细胞长至60%～70%,加入不同浓度的BPA(0、2、10、50、250μmol/L)的培养基染毒24 h,每个剂量设置3个复孔,用CCK8检测活力,每孔加入10μl的CCK8试剂溶液,混匀后在37℃、5%CO2培养箱继续培养2 h,之后于酶标仪450 nm波长处测光密度值,计算细胞存活率。

1.2.3 miRNA表达检测

应用Trizol法对处理后的细胞进行总RNA提取后,应用核酸浓度检测仪进行RNA质量检测,使用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit进行RNA逆转录,用7500 FAST PCR仪进行qPCR。miRNA引物见表1。

表1 miRNA引物序列情况

1.2.4 RNA表达检测

应用Trizol法对处理后的细胞进行总RNA提取后,应用核酸浓度检测仪进行RNA质量检测,使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)进行RNA逆转录,用7500 FAST PCR仪进行qPCR。mRNA引物见表2。

表2 mRNA引物序列情况

1.3统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学处理,符合正态分布的计量资料用x¯±s表示,服从正态分布且满足方差齐性时采用单因素方差分析和LSD法进行统计学处理,不符合则采用非参数检验。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 BPA对TM3细胞活力的影响

BPA处理24 h后,与对照组相比,处理组出现下降趋势,50、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001),且在镜下可观察到有大量脱壁死亡的细胞,D、E组尤为明显。见图1、图2。

图1不同浓度BPA对睾丸间质细胞染毒24 h后细胞存活率

图2不同浓度BPA对TM3细胞染毒24 h后细胞状态(20×)

2.2 BPA对miR-203-3p相对表达量的影响

BPA处理24 h后,与对照组相比,各处理组miR-203-3p表达量升高,且10、250μmol/L组升高显著,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3不同浓度BPA对睾丸间质细胞染毒24 h后细胞中miR-203-3p的相对表达量

2.3 BPA对FOXO1相对表达量的影响

BPA处理24 h后,与对照组相比,2、10μmol/L组FOXO1表达量升高,50、250μmol/L组表达量降低,2、50、250μmol/L组FOXO1相对表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。见图4。

图4不同浓度BPA对睾丸间质细胞染毒24 h后细胞中FOXO1的相对表达量

2.4 BPA对AKT相对表达量的影响

BPA处理24 h后,与对照组相比,各处理组AKT相对表达量均出现下降趋势,且10、50、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。见图5。

图5不同浓度BPA对睾丸间质细胞染毒24 h后细胞中AKT的相对表达量注:***与对照组相比，P<0.001

2.5 BPA对PI3K相对表达量的影响

BPA处理24 h后,与对照组相比,各处理组PI3K相对表达量均出现下降趋势,且50、250μmol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。见图6。

图6不同浓度BPA对睾丸间质细胞染毒24 h后细胞中PI3K的相对表达量

3、讨论

表观遗传因素在男性不育中起着重要作用,尽管约60%～65%的疾病是特发性的,其潜在原因尚不清楚。许多研究表明,表观遗传修饰可能与特发性男性不育有关,其中包括DNA甲基化、组蛋白尾部修饰、染色质重塑和非编码RNA;异常甲基化与精子质量和生育能力下降有关,已知1 881个miRNA与男性生育能力相关,而piRNA、IncRNA、circRNA等非编码RNA在男性生殖中起调节作用[16,17]。

本课题组在体内实验通过基因芯片及Pathway分析得到miR-203-3p及FOXO信号通路有关联[11],并通过本实验验证miR-203-3p和FOXO信号通路的关联;与Lee等[18]的研究结果一致。

BPA处理细胞24 h后,细胞活力随剂量的增大而减少,而且50μmol/L组和250μmol/L组与对照组比较差异有统计学意义,这一结果与前期实验研究结果相似[11]。50μmol/L组和250μmol/L组镜下可见大量脱壁死亡细胞,表明BPA对细胞有一定的细胞毒性。miRNA是FOXO1翻译的重要调节因子,干扰FOXO1 mRNA的合成[19,20,21]。本研究发现,不同剂量BPA对细胞中miR-203-3p的相对表达量的影响不同,随着BPA剂量的升高,miR-203-3p的相对表达量变化趋势不一致,在10、250μmol/L组出现升高且差异有统计学意义。有研究显示,BPA所产生的毒作用不一定遵循传统的剂量-反应关系[22,23,24],与本实验结果一致。

叉头转录因子家族的“O”亚类由4个成员组成,包括FOXO1(FKHR)、FOXO3a(FKHRL1)、FOXO4(AFX)和FOXO6;FOXO2被认为是FOXO3的同源物,FOXO5仅在斑马鱼中表达[25,26]。FOXO1可以调节许多靶基因,如凋亡和自噬相关基因、抗氧化酶、细胞周期阻滞基因、代谢和免疫调节基因等[27,28]。本研究发现,与对照组相比,2、10μmol/L组FOXO1表达量升高,50、250μmol/L组表达量降低,且2、50、250μmol/L 3个剂量组FOXO1相对表达量与对照组比较差异有统计学意义。陈威[14]研究结果表明,SD大鼠接触BPA后,引起PI3K/AKT/FOXO1信号通路改变,从而影响睾丸组织细胞的损伤,结果显示,高浓度BPA暴露引起凋亡细胞数量增多,凋亡执行蛋白caspase 3活化,PI3K/AKT/FOXO1信号通路被抑制。

研究表明,PI3K/AKT信号通路参与了与细胞生长、增殖、分化、运动、生存和代谢相关的信号转译[29]。FOXO1的转录活性是通过PI3K/AKT通路等信号通路介导的[30]。本研究发现,与对照组相比,PI3K/AKT的相对表达量在各处理组均出现下降趋势,且在50、250μmol/L组差异有统计学意义;同时,AKT在10μmol/L组差异有统计学意义。这种下降趋势主要与miRNA的调控机制有关,miRNAs与具有互补序列的信使RNA(MRNAs)结合并抑制它们的翻译,抑制特定蛋白质的产生[8]。

综上所述,BPA浓度的逐渐增加,对睾丸间质细胞的损伤逐渐加重,这可能与miR-203-3p表达的改变及PI3K/AKT/FOXO1信号通路有关,需进一步研究miR-203-3p与PI3K/AKT/FOXO1信号通路的关系,靶向证明miRNA与PI3K/AKT/FOXO1相关靶基因的关系,并为今后的BPA对雄性生殖毒性机制研究提供线索。

参考文献：

[7]高丽云,聂林坤,李潇,等.微小RNA和长链非编码RNA在男性生殖系统疾病中的作用研究进展[J].新乡医学院学报,2018,35(8):651-653.

[9]单鑫,朱根宝,刘亚.MicroRNA与生殖[J].黑龙江畜牧兽医,2018,(15):43-46.

[11]马林,李丹,李昀谦,等.双酚A对小鼠睾丸间质细胞毒性及miR-203-3p表达的影响[J].环境与职业医学,2019,36(5):484-489.

[14]陈威.双酚A暴露引起青春前期大鼠睾丸中精子发生障碍及PI3K/AKT/FOXO1信号通路介导的凋亡[D].武汉:华中科技大学,2017.

梁书秋,陶亚楠,李丹,张玉敏,裴秀丛,段志文,马明月.双酚A对小鼠睾丸间质细胞毒性及miR-203-3p和PI3K/AKT/FOXO1信号通路的影响[J].实用药物与临床,2020,23(07):584-588.

基金:辽宁省自然科学基金指导计划项目(2019-ZD-0317).