锌指结构域蛋白SALL4A介导的DNA去甲基化修饰对心脏发育和功能的影响

2020-07-27 420 上传者：管理员

摘要：目的:探讨锌指结构域蛋白SALL4A介导的DNA去甲基化修饰对心脏发育和功能的影响。方法:选取SALL4A基因敲除SD小鼠10只,正常SD小鼠10只。分为正常组和基因敲除组。应用免疫印迹Westernblot法测定蛋白表达量,应用RT-QPCR法检测基因表达量及基因表型鉴定。结果:正常组和基因敲除组小鼠心室重量和心室重量/体重的变化结果显示,在饲养SD小鼠8周以后,基因敲除组的心室重量为0.34±0.05mg,显著低于正常组的0.54±0.04mg,具有统计学意义(P<0.05)。基因敲除组的心室重量/体重比值为4.31±0.75,显著低于正常组的5.21±0.84(P<0.05)。正常组和基因敲除组小鼠各心脏指标比较结果显示,与正常组相比,模型组的心室内径,收缩期室间隔厚度,收缩期左心室后壁厚度,LVEF%和LVFS%差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,与正常组相比,基因敲除组的DNMT1,DNMT3a,DNMT3b基因表达量降低(P<0.05)。SALL4A,Tet1,Tet2和Tet3的基因表达量与正常组相比降低(P<0.05)。WB结果显示,模型组Popdc和cAMP蛋白表达量与正常组相比降低(P<0.05)。结论:锌指结构域蛋白SALL4A参与DNA去甲基化修饰从而对心脏发育和功能产生影响。

关键词：
DNA去甲基化
心功能
心脏发育
心血管
锌指结构域蛋
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心血管疾病是目前公认的影响人类身心健康的常见多发疾病[1,2]，致死率很高，中老年是疾病十分易发的人群[3,4]。到目前为止，心肌缺血，心肌梗死心或肌代谢障碍等病症的治疗依然没有找到合适的方法[5,6]，早期的治疗主要是通过溶栓等方式疏通血管[7]，但是大部分心脏患者在发现心脏疾病后，治疗效果都不是特别明显[8]。DNA甲基化是遗传学较常见的修饰形式[9]，它是一个动态的调节过程，遗传学修饰形式除了DNA的甲基化[110]，还有DNA的去甲基化，DNA的甲基化指的是DNA链上面的二核酸胞嘧啶在甲基化转移酶的作用下，形成5-mc(5甲基胞嘧啶）的过程。去甲基化包括两种形式，一种是主动去甲基化，一种是被动去甲基化，主动去甲基化是指由TET(DNA加氧酶）介导的向去甲基状态发展的过程。被动去甲基化指的是消除细胞中的DNA甲基化转移酶DNMTs，达到抑制DNA复制过程中产生的甲基化过程。锌指结构蛋白是由二价锌离子结合蛋白以后形成的可以折叠的蛋白质[16,17]，因为此类蛋白折叠的形状类似于手指，故而得名。它在细胞中作用十分重要，可以与RNA或者DNA链结合，所以可以参与调控基因，参与细胞分化以及胚胎发育等作用。根据其和DNA或RNA结合位置不同，可以分为很多构型，包括C6,C4和C2H2。本文即探究锌指结构域蛋白SALL4A介导的DNA去甲基化修饰对心脏发育和功能的影响。

1、资料与方法

1.1实验动物

选取天津SALL4A基因敲除SD小鼠10只，正常SD小鼠10只，由天津实验动物中心提供。正常组小鼠和SALL4A基因敲除SD小鼠在饲养期间饲养温度为30℃，湿度为47%。在试验期间饮食水自由，每天保证至少8h照明时间。

1.2实验方法

1.2.1小鼠的基因型鉴定

提取DNA，将小鼠尾巴剪掉，之后加入90μL的氢氧化钠溶液，99摄氏度下水浴1h。90μL的Tris-HCL加入到水浴，充分混匀，离心取上清，提DNA，设计引物PCR鉴定基因表达量。循环40次，最高升温到95℃5分钟，维持93℃40s，降温到62℃维持40s，升温到75℃40s,72℃5分钟，4℃扩增30min。

1.2.2RT-PCR法测定基因表达量

将50×的TAE稀释为1×TAE溶液作为溶剂，称取0.5g琼脂糖，加入到1×TAE溶液当中。之后在微波炉中加热煮沸，后加入4μL的核酸染料，摇晃混匀。最后将琼脂糖凝胶水平放入电泳槽，依次加入5μL的DNAMaker以及目的基因PCR扩增产物。（见表1)

表1RT-PCR过程中引物序列（n=10)

1.2.3WesternBlot法测定蛋白含量

把NC膜放入到平皿，后在容器中添加脱脂奶粉并在摇床上暗处封闭0.5-1.5h。弃去奶粉，取出NC膜置于TBST中洗涤3次。洗涤以后加入1抗，在4℃下孵育过夜。NC膜于第二天取出，将膜放于TBST溶液中洗涤4次后加入2抗孵育，将配置好的显色液滴加覆盖于NC膜上。1mL从右至左缓慢滴加，胶片冲洗，扫描留存。

1.3统计学分析

应用SPSS20.1软件统计分析，数据以“均数±标准差”表示，方差齐性检验后，组间比较应用t检验；组间比较应用χ2分析；P<0.05代表差异存在统计学意义。

2、结果

2.1正常组和基因敲除组小鼠心室重量和重量/体重值比较

见表2。

表2正常组和基因敲除组小鼠心室重量和心室重量/体重比较（n=10)

2.2正常组和基因敲除组小鼠各心脏指标比较

见表3。

表3正常组和基因敲除组小鼠各心脏指标比较（n=10)

2.3正常组和基因敲除组小鼠DNMT1,DNMT3a和DNMT3b基因表达量比较

见表4、图1。

表4各组小鼠DNMT1,DNMT3a和DNMT3b基因表达量比较（n=10)

图1RT-QPCR检测DNMT1,DNMT3a和DNMT3b基因表达情况

2.4正常组和基因敲除组小鼠SALL4A,Tet1,Tet2和Tet3基因表达量比较

见表5、图2。

表5各组小鼠MICRORNA和FXO3基因表达量比较（n=10)

图2RT-QPCR检测SALL4A,Tet1,Tet2和Tet3基因表达情况

2.5正常组和基因敲除组小鼠Popdc和cAMP蛋白表达量比较

见表6、图3。

表6各组小鼠心肌组织Popdc3和cAMP蛋白表达量比较（n=10)

图3WesternBlot检测心肌组织中Popdc3和cAMP蛋白表达情况

3、讨论

心室重量和心室重量/体重是评价心脏组织发育程度的直观指标[19]，本实验显示，正常组和基因敲除组小鼠心室重量和心室重量/体重与基因敲除组相比，各指标均优于基因敲除组。心室内径，间隔厚度，LVEF%和LVFS%是衡量心脏健康程度的指标，各指标的升高直接正向联系于心脏的发育程度。本实验结果显示，SALL4A基因的敲除会影响小鼠的心脏发育。常见的修饰形式就是DNA的甲基化和去甲基化，甲基化是指在DNA转移酶DNMT的作用下，使CpG的位C原子形成5mc，常见的DNMTs主要包括DNMT1,3a,3b,3L,DNMTs的含量直接反应机体的甲基化程度。有文献指出，DNMT的含量变化与心脏组织的发育生长情况呈现一定关联[19]，本实验显示，SALL4A对DNMT1,DN-MT3a,DNMT3b基因的调控作用。DNA的主动去甲基化是指由DNA双加氧酶TET蛋白家族介导的由甲基化状态向去甲基化状态的转变过程，随着去甲基化程度的升高，心脏的生长发育会得到一定程度的改善。本实验显示，Tet1,Tet2和Tet3基因在心脏发育中的作用正向调控作用。以及SALL4A基因与Tet1,Tet2和Tet3的分泌表达的关系。Popdc3是评价心脏功能的重要蛋白，其在心肌和骨骼肌中具有重要功能。大量数据显示Popdc3蛋白在心脏病患者的心肌细胞中会低表达[21]，其与心脏生理信号的传递，细胞的新生和细胞功能的维持都有重要的作用。本实验显示，基因敲除组的cAMP蛋白表达量与正常组相比呈现显著降低趋势。此结果与SALL4A基因调控心脏组织的生长结果相一致。

综上所述，锌指结构域蛋白SALL4A是通过调控基因DN-MT1,DNMT3a,DNMT3b,Tet1,Tet2和Tet3的表达从而调节DNA的去甲基化作用，最终影响心脏功能的关键蛋白Popdc3和cAMP的表达量调控心脏发育。

王照璞,曹钢,徐晖.锌指结构域蛋白SALL4A介导的DNA去甲基化修饰对心脏发育和功能的影响[J].名医,2020(11):1-3.