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温阳活血化痰方对蒽环类药物心脏损伤的保护机制

2021-09-28 63 上传者：管理员

摘要：目的:研究温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤的保护作用。方法:将SD大鼠随机分为6组,空白组,模型组,温阳活血化痰方低、中、高剂量组,奥诺先组。除空白组外,其余大鼠每周给予2.5mg•kg-1阿霉素腹腔注射6周,累计剂量为15mg•kg-1。温阳活血化痰方低、中、高剂量组每日分别予4.86,9.72,19.44g•kg-1灌胃。空白组、模型组、奥诺先组每日予生理盐水10mL•kg-1灌胃。奥诺先组每周于阿霉素前30min腹腔注射奥诺先25mg•kg-1,干预6周。观察大鼠一般状况并监测体质量;高分辨率小动物超声影像系统检测大鼠心功能;苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠心肌组织病理形态学改变;蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测大鼠心肌组织中微管相关蛋白I轻链3（LC3）Ⅱ,自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin-1）,p62蛋白的表达变化。结果:与空白组比较,模型组大鼠皮毛无光泽,进食量及活动量减少,部分便溏,精神不振,反应迟钝;体质量显著降低（P<0.01）;左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短率（LVFS）均显著降低（P<0.01）;心肌细胞变性、水肿、断裂、溶解;心肌间质间隙扩大;心肌纤维染色不均;可见炎性细胞浸润;大鼠心肌组织中Beclin-1,LC3Ⅱ表达显著增加（P<0.01）,p62显著降低（P<0.01）。与模型组比较,温阳活血化痰方高、中剂量组体质量,LVEF,LVFS均显著增加（P<0.01）;心肌组织病理损伤不同程度减轻;LC3Ⅱ,Beclin-1蛋白表达下降（P<0.05,P<0.01）,p62表达增加（P<0.05,P<0.01）。结论:温阳活血化痰方能有效地防治阿霉素心脏损伤,其作用可能与抑制心肌细胞自噬机制相关,以高剂量效果更佳。

关键词：
心脏损伤
活血化痰
自噬
阿霉素
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蒽环类药物是一种广泛的抗肿瘤药物，临床应用较广泛，心脏损伤是其最为严重的不良反应，以阿霉素为代表。恶性肿瘤患者由化疗药物引起心脏损伤的死亡风险甚至已超过了癌症复发的风险。临床显示蒽环类药物心脏损伤多呈进展性和不可逆性，特别是初次使用蒽环类药物就易造成心脏损伤，早期监测和积极预防蒽环类药物引起的心脏损伤显得尤为重要。因此肿瘤药物治疗引起心脏损伤的防治是肿瘤学专家和心脏病学专家共同面临的挑战。目前，铁螯剂右丙亚胺（DZR）是唯一公认的推荐用于预防蒽环类心脏损伤的药物，虽然被证明有一定的心脏保护作用，但多项研究发现临床使用可降低蒽环类药物的临床疗效。因此至今，仍没有一种药物或是方法可以完全地预防蒽环类抗肿瘤药物引起的心脏损伤而不降低其抗癌疗效。积极寻找一种有效的且更安全的防治蒽环类心脏损伤的药物仍是一个严峻的挑战。中医药在拮抗蒽环类药物心脏损伤方面的研究已成为热点。

目前研究发现蒽环类心脏损伤心肌损伤是多种因素共同作用的结果，主要包括氧化应激、铁代谢障碍、线粒体功能损伤、拓扑异构酶2等。近年研究发现，细胞自噬是蒽环类心脏损伤的重要机制之一。研究表明黄芪多糖能通过调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调节自噬，减轻阿霉素引起的心脏损伤[。中药复方研究发现当归补血汤可能通过激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）介导蛋白激酶B(Akt）/mTOR信号通路，抑制心肌细胞自噬，减轻阿霉素小鼠的心脏损伤。中医药防治抗肿瘤药物治疗的心脏损伤具有独特的优势和临床疗效，但其深层的机制还需要深入研究。本研究基于本虚标实的病机，从“痰瘀互结”角度，提出温阳活血化痰方可能通过调控自噬防治蒽环类心脏损伤的假说，探讨温阳活血化痰方对蒽环类心脏损伤的保护机制，为温阳活血化痰方治疗蒽环类心脏损伤提供理论依据。

1、材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，体质量（200±20)g，合格证号20170012007541。饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物房，使用许可证号SYXK（沪）2018-0040。室内温度控制（22±2）℃，相对湿度（55±10）%，每日光照12h，避光12h，标准饲料和饮用水自由摄取。实验动物经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院伦理委员会批准，批号YYLAC-2019-028。

1.2药物

温阳活血化痰方：黄芪30g，桂枝9g，赤芍15g，丹参15g，泽泻30g，姜半夏9g。于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科购买，经药剂科朱晓春主管药师鉴定均为正品。上6味加水煎煮，去渣浓缩，浓缩至1.94g·mL-1,4℃冰箱保存，用蒸馏水稀释至所需浓度。阿霉素（注射用盐酸多柔比星，瀚晖制药有限公司，国药准字H33021980,10mg/支）；奥诺先（江苏奥赛康药业有限公司，国药准字H20061157,250mg/瓶）。

1.3试剂

自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin-1），微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3),p62，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国CellSignalingTechnology公司，批号分别为3738,2775,39749,5174）；羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（上海碧云天公司，批号A0208）；苏木素，伊红（台湾Baso公司，批号分别为714094,BA4099）。

1.4仪器

Vevo2100型小动物超声影响系统（美国Visualsonics公司）；miniprotean3cel型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；PS-9型电转仪，ST-1型半干式转移电泳槽（中国竞迈科技有限公司）；MK3型酶标仪（芬兰雷勃公司）；Tanon-5200型成像系统（中国Tanon公司）；SQ2125型石蜡切片机（中国徕克公司）；VistarImage型显微图象分析系统（日本Nikon公司）；DHG-9023A型恒温烘箱（中国上海恒一科学仪器有限公司）。

2、方法

2.1分组

SD大鼠90只，适应喂养3d。采用随机数字分组法按体质量将大鼠分为6组，空白组（n=10），模型组（n=16），温阳活血化痰方低、中、高剂量组（n=16），奥诺先组（n=16）。

2.2模型制备

采用大鼠腹腔注射阿霉素，建立阿霉素心脏损伤大鼠模型[13]。腹腔给药，除空白组大鼠外，对其他各组大鼠进行腹腔注射阿霉素2.5mg·kg-1，每周1次，连续用药6周，累计剂量为15mg·kg-1。空白组给予同等体积的生理盐水腹腔注射，每周1次，连续用药6周。

2.3干预

造模同时给予干预治疗，连续给药6周。温阳活血化痰方低、中、高剂量每日分别予温阳活血化痰方4.86,9.72,19.44g·kg-1灌胃。空白组、模型组、奥诺先组每日予生理盐水10mL·kg-1灌胃。奥诺先组每周于阿霉素前30min腹腔注射奥诺先25mg·kg-1（右丙亚胺-阿霉素10︰1）。中药给药剂量根据人常用临床剂量并按照成人（按60kg计算）和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表（大鼠的折算系数为6.3）换算出大鼠所需中药给药剂量[14]。

2.4观察指标及方法

2.4.1观察大鼠

一般情况变化并监测体质量变化观察大鼠活动情况、饮食情况、粪便性状、毛发改变等一般情况，并每周测量大鼠体质量。

2.4.2心功能检测

使用高分辨率小动物超声影像系统检测大鼠心脏功能。将大鼠放入气体麻醉机，接通麻醉通道，待大鼠麻醉后脱去大鼠左胸部被毛，固定于心超机上。使用持续气体麻醉烷保持麻醉状态。大鼠左心前区及探头上涂抹偶联剂，以高频探头进行定位，将探头至于左胸部，分别记录左心室射血分数（LVEF），左心室缩短率（LVFS）。

2.4.3苏木素-伊红（HE）染色观察心脏组织

给药结束后，禁食12h。麻醉后，从主动脉根部游离出心脏，剪除心脏血管残端等其他组织，分离出全心，取出心脏并用预冷的生理盐水冲洗，去除血液后用滤纸吸干。将部分心肌组织固定于4%多聚甲醛中，HE染色后光镜下进行心肌组织形态学观察。

2.4.4蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测心脏组织中LC3Ⅱ，Beclin-1,p62蛋白表达

大鼠部分心肌组织，液氮迅冻后转至-80℃冰箱保存。将心肌组织经裂解液匀浆后裂解后，冰浴静置20min，混匀后4℃，12000r·min-1离心15min，离心半径6cm，取上清液，BCA法进行蛋白定量。上样缓冲液与适当蛋白匀浆混匀后，置于沸水中加热10min，冷却至室温，以凝胶电泳分离并转膜，TBST洗膜5min,5%脱脂奶粉4℃过夜。加入稀释的相应一抗（Beclin-11∶1000,p621∶1000,LC3Ⅱ1∶1000,GAPDH1∶2000），摇床孵育2h,TBST洗膜3次，每次5min。加入二抗（1∶1000）配制进行37℃摇床孵育1h,TBST洗膜3次，每次5min，结束后显色，测量条带灰度值，并以目标条带与内参条带灰度的比值反映目标蛋白的表达情况。

2.5统计学分析

采用SPSS22.0进行数据统计分析。计量资料，采用表示。如检测指标符合正态分布且方差齐性时采用完全随机设计资料方差分析，如各组之间的差异有统计学意义，则选用SNK法进行多组均数的两两比较，如检测指标不符合正态分布或方差不齐时采用Kruskal-Wallis秩和检验，如各组之间的差异有统计学意义，则采用WilcoxonRankSum检验进行多组的两两比较，并根据比较的组数修正检验水准。以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤大鼠一般状况影响

空白组大鼠皮毛光滑，食欲正常，大便正常，反应迅速敏捷，精神状况良好；模型组大鼠皮毛无光泽，进食量及活动量减少，部分便溏，精神不振，反应迟钝；温阳活血化痰方组和奥诺先组大鼠状态处于正常组和模型组两者之间。死亡情况，模型组死亡2只，温阳活血化痰方低剂量组死亡1只，奥诺先组大鼠因腹腔注射失误死亡1只。

3.2温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤大鼠体质量影响

药物干预3周，与空白组比较，模型组体质量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，温阳活血化痰方中、高剂量组体质量显著增加（P<0.01），奥诺先组体质量明显增加（P<0.05）。药物干预6周，与空白组比较，模型组体质量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，温阳活血化痰方中、高剂量组和奥诺先组体质量均显著增加（P<0.01）。见表1。

3.3温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤大鼠心脏功能影响

与空白组比较，模型组LVEF和LVFS均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，温阳活血化痰方中、高剂量组和奥诺先组LVEF均显著升高（P<0.01）；温阳活血化痰方中、高剂量组LVFS均显著升高（P<0.01），奥诺先组LVFS明显升高（P<0.05）。见表2。

3.4温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤大鼠心肌组织病理的影响

空白组大鼠心肌纤维排列规整，细胞核多位于肌纤维中央；模型组心肌细胞变性、水肿、断裂、溶解；心肌间质间隙扩大；心肌纤维染色不均；可见炎性细胞浸润；奥诺先组心肌细胞变性、水肿；心肌间质间隙扩大；心肌纤维染色不均；程度较模型组均有所减轻；温阳活血化痰方高、中、低剂量组心肌损伤程度均较模型组有不同程度的减轻，以中、高剂量组较为明显。见图1。

3.5温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤大鼠心肌组织自噬相关蛋白LC3Ⅱ，Beclin-1,p62影响

与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中Beclin-1,LC3Ⅱ表达显著增加（P<0.01),p62显著降低（P<0.01）。与模型组比较，温阳活血化痰方中、高剂量组、奥诺先组LC3Ⅱ表达明显降低（P<0.05,P<0.01),p62表达明显增加（P<0.05）。温阳活血化痰方低、中、高剂量组、奥诺先组Beclin-1表达均显著降低（P<0.01）。见图2，表3。

4、讨论

中医古籍虽无蒽环类药物所致心脏损伤记载，现代医家根据心慌、气短、乏力、胸闷等心肌受损症状，多将其归于“心悸”“胸痹”等范畴。中医学理论认为其病机多为心阳虚弱为主，痰瘀互结为标。由于痰源于精，瘀源于血，由“精血同源”可得“痰瘀同源”，痰瘀均由精血所化，属阴，其性重浊凝滞，胶结难化，痰瘀可相互转化，不可分离，瘀不去，则痰不可净，痰不化，则瘀难消。王彩琴[15]也认为蒽环类药物心脏损伤病机主要是心阳受损或心之气阴不足，推动血液无力，气滞血瘀，以气虚气滞夹瘀为主。因此该研究选用温阳活血化痰方温阳的基础上，痰瘀同治，痰化瘀消，标本同治。温阳活血化痰方由黄芪、桂枝、赤芍、丹参、泽泻、姜半夏药物组成。方中黄芪甘温，补气升阳，桂枝温经通脉，助阳化气。《金匮方歌括》言：“桂枝振心阳，如离照当空，则阴霾全消，而无日复明也。”两药合用，共为君药，益气温阳以治其本。阳气来复，则阴寒散，瘀血祛，水饮消，可谓益火之源，以消阴翳。赤芍、丹参活血化瘀，半夏燥湿化痰，泽泻利水渗湿。诸药合用，痰瘀同治，痰化瘀消，共奏温阳益气活血化痰之功，具有良好的临床疗效。

阿霉素药物心脏损伤的机制目前尚未明确阐明，心肌细胞自噬失调是阿霉素心脏损伤的发病机制之一。自噬是一种细胞内降解细胞质元素的机制，生理条件下自噬通过清除细胞中多余或受损的蛋白质和细胞成分，保持心脏正常结构和功能；病理条件下自噬被过度激活，对心肌细胞产生有害作用。Beclin-1是自噬早期发生至关重要的因子，可募集自噬相关调节因子，激活下游基因的表达，是阿霉素刺激自噬体形成的关键蛋白之一。LC3是自噬体膜上的标记蛋白，它有两种形式：LC3Ⅰ和LC3Ⅱ。LC3最初以proLC3形式进行合成，proLC3切割C端变成LC3Ⅰ，自噬激活后，LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺（PE）偶联形成脂质化LC3Ⅱ，LC3Ⅱ是唯一与完整的自噬体可靠结合的蛋白质标志物，在自噬体形成过程中是必不可少的。p6参与自噬体的降解过程，在自噬流下游p62作为一种选择性自噬受体，可以直接与LC3Ⅱ结合并被自噬选择性降解。p62为评价自噬降解的指标。因此，Beclin-1,LC3Ⅱ和p62被认为是自噬发生发展的重要指标，同时检测LC3Ⅱ和p62蛋白表达，可衡量自噬流的标准。研究表明，蒽环类药物会增加心肌细胞自噬空泡的形成，造成心脏损伤，抑制自噬启动和自噬小体形成能保护心脏功能，避免心肌受损[。MA等在探讨芦丁对心肌细胞死亡的保护作用机制时发现，芦丁可抑制Akt激活介导的过度自噬和凋亡，从而有效地减轻阿霉素引起的心脏损伤。

本研究通过阿霉素药物心脏损伤模型建立，结果显示模型组大鼠皮毛无光泽，进食量及活动量减少，部分便溏，精神不振，反应迟钝，体质量显著降低。与模型组比较，温阳活血化痰方各组大鼠一般状态均有不同程度改善，温阳活血化痰方中、高剂量组体质量均显著增加。观察温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤大鼠心功能的影响，结果提示，与模型组比较，温阳活血化痰方中、高剂量组LVEF,LVFS均升高，温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤心功能具有改善作用。通过对心肌组织细胞HE染色，发现模型组大鼠心肌病理组织发生改变，与模型组比较，温阳活血化痰方高、中、低剂量组心肌损伤改变均有不同程度减轻。提示温阳活血化痰方对心肌细胞具有保护作用，能有效的防治阿霉素心脏损伤。

为进一步探讨其可能的机制，通过对自噬相关蛋白的检测，研究发现与空白组比较，模型组自噬相关蛋白LC3Ⅱ，Beclin-1表达明显增加，p62蛋白表达降低，表明自噬降解途径能够及时清除与LC3Ⅱ结合的p62蛋白，而LC3Ⅱ的累积与自噬降解途径累积无关，与LC3Ⅰ转变的LC3Ⅱ增多相关，说明自噬水平被过度激活，提示阿霉素心脏损伤可能与自噬过度激活有关。与模型组比较，温阳活血化痰方能降低LC3Ⅱ，Beclin-1蛋白表达，增加p62蛋白表达。提示温阳活血化痰方可调控心肌细胞自噬蛋白水平。

综上，温阳活血化痰方可能通过下调LC3Ⅱ，Beclin-1蛋白，增加p62蛋白表达，抑制过度激活的自噬水平，拮抗阿霉素药物心脏损伤。本研究结果提示温阳活血化痰方对阿霉素心脏损伤具有保护作用，可能与抑制过度激活的自噬水平有关，这可能是温阳活血化痰方防治阿霉素心脏损伤的分子作用机制之一，为临床治疗阿霉素心脏损伤提供新思路。今后研究中将进一步探讨温阳活血化痰方调控细胞自噬的具体分子机制。

文章来源：王立玉,沈雁,刘睿斯,徐婕,曹玉.温阳活血化痰方对蒽环类药物心脏损伤的保护机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):80-86