首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 儿科论文 > 手足口病论文 > 川楝素对柯萨奇病毒A16型体外抑制效应的研究

川楝素对柯萨奇病毒A16型体外抑制效应的研究

2023-08-15 150 上传者：管理员

摘要：探究川楝子提取物川楝素对柯萨奇病毒A16型(CA16)复制的抑制作用，及其相关的作用机制。方法将HCT116细胞分成空白组、阳性对照组与实验组。实验组用50μg•mL-1川楝素培养CA16感染细胞，阳性对照组用24.4μg•mL-1利巴韦林培养CA16感染细胞，空白组给予正常培养。用CCK-8实验检测川楝素对CA16感染的HCT116细胞活性的影响，用病毒空斑实验检测CA16的感染和复制能力，用蛋白质印迹法检测病毒结构蛋白VP1和清道夫受体B2(SCARB2)的表达情况。结果空白组、阳性对照组和实验组细胞的病毒空斑数分别为(52.34±12.01)、(20.88±6.47)和(18.25±6.63)个，VP1蛋白相对表达水平分别为1.87±0.14、0.77±0.11和0.74±0.09,SCARB2蛋白相对表达水平分别为0.96±0.13、0.26±0.10和0.23±0.09。实验组的上述指标与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论川楝素能通过降低CA16中SCARB2的表达，从而抑制其在细胞内的复制。

关键词：
川楝素
手足口病
柯萨奇病毒A16型
清道夫受体B2
肺炎
加入收藏

柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病的主要病原体[1]。虽然CA16引起的手足口病以轻症为主，但也可导致感染者出现重症及死亡，其常见的重症症状包括心肌炎、无菌性脑膜炎和肺炎等[2]。目前，针对CA16主要是通过注射疫苗与中和抗体[3]来获得主动免疫。川楝素(Toosendanin, TSN)是传统中药川楝子的有效提取物，具有抗肉毒、杀虫、抗病毒[4]等作用。虽然川楝素的作用众多，但其也具有一定的肝毒性、妊娠毒性[5,6]。在用川楝素治疗疾病时，应该严格把控剂量，防止产生严重的药物不良反应。本研究通过体外实验探索川楝素的合理使用浓度，并进一步探究该浓度下的川楝素对CA16复制的抑制作用以及可能的分子机制。

一、材料与方法

1、材料

病毒与细胞CA16,购自病毒株中国典型培养物保藏中心；结肠癌细胞系HCT116,本实验室冻存。

药品与试剂川楝素，纯度：≥98%,批号：58812-37-6,购自成都格力普生物科技有限公司；利巴韦林，纯度：≥98%,批号：36791-04-5,购自湖北万业众诚化学试剂有限责任公司。病毒结构蛋白VP1、清道夫受体B2(scavenger receptor B2,SCARB2)一抗，均购自美国Abcam公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗，均购自上海碧云天公司；CCK-8,购自日本同仁公司。

仪器Multiskan SkyHigh全波长酶标仪，美国赛默飞公司产品；NI-U正置显微镜，日本尼康公司产品；ChemiDoc MP扫膜仪，美国伯乐公司产品。

2、实验方法

2.1细胞培养

HCT116细胞用含10%胎牛血清(fatal bovine serun, FBS)的DMEM培养基，并在完全培养基中加入1%的双抗(青霉素、链霉素),于含5%CO2、37℃培养箱中培养[4]。

2.2细胞分组与处置方法

最佳作用浓度将HCT116细胞分为空白组和实验组。空白组用完全培养基进行正常培养，实验组用含500、250、100、50、25和10μg·mL-1川楝素的完全培养基进行培养[4]。

最佳给药浓度将HCT116分为空白组、阳性对照组和低、中、高浓度实验组。空白组用完全培养基正常培养HCT116细胞；阳性对照组用含24.4μg·mL-1利巴韦林的完全培养基培养CA16感染的HCT116细胞；高、中、低浓度实验组分别用含50、25和10μg·mL-1川楝素的完全培养基培养CA16感染的HCT116细胞[3]。

2.3用CCK-8实验检测细胞活性[4]4]

调整细胞密度为1×106 cell·mL-1,每孔3μL,按“2.2”的方法进行分组和处置，加药培养24 h后，加入CCK-8溶液100μL,孵育1 h后，用酶标仪在450 nm处检测各孔的光密度(optical density, OD)值。每次测量重复10个复孔，实验重复3次。

2.4用病毒空斑实验检测CA16的感染和复制能力[6]6]

调整细胞密度为1×106 cell·mL-1,每孔100μL,按“2.2”的方法进行分组和处置(其中实验组只用50μg·mL-1川楝素处理),均匀接种于6孔板中，待细胞平铺80%以上，弃去上清液，加入37℃预温的含1.5%甲基纤维素的DMEM培养基继续培养3 d后，加入4%多聚甲醛固定细胞4 h,用结晶紫染色15 min后，冲洗多余染料，计数空斑形成个数。每次重复3个复孔，实验重复3次。

2.5用蛋白质印迹法检测各组细胞VP1和SCARB2的表达水平[4]4]

调整细胞密度为1×106 cell·mL-1,每孔100μL,按“2.2”的方法进行分组和处置(其中实验组只用50μg·mL-1川楝素处理),培养24 h后，用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)清洗，加入RIPA裂解液裂解细胞，收集总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转PVDF膜。用5%BSA封闭1 h后，加入相应一抗4℃孵育过夜，用PBS清洗3次，每次10 min。然后加入1∶1 000二抗稀释液室温孵育1 h,用PBS清洗3次，每次10 min,用凝胶成像系统成像。以β-actin为内参，用Image J分析各目的蛋白的相对表达水平。

3、统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。实验数据用x¯±s表示，2组间比较用配对样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1川楝素对HCT116细胞活性的影响

为了探索不同浓度川楝素对HCT116细胞活性的影响，用CCK-8实验检测各组细胞经10～500μg·mL-1川楝素处理后的活性，结果显示，当川楝素质量浓度≥100μg·mL-1时，细胞活性与0μg·mL-1组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05);当川楝素质量浓度≤50μg·mL-1时，川楝素对HCT116无明显毒性。结果见表1。故选择10、25和50μg·mL-1浓度进行后续实验。

2川楝素对CA16感染的HCT116细胞活性的影响

为了探索不同浓度川楝素对CA16感染的HCT116细胞活性影响，用CCK-8实验检测各组细胞在经过川楝素处理后的活性，结果显示，低、中、高浓度实验组和阳性对照组的细胞活性与空白组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);且低、中浓度实验组的细胞活性与阳性对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。故本研究认为川楝素质量浓度为50μg·mL-1是CA16感染的HCT116细胞的最佳给药浓度。

3川楝素对CA16复制的影响

病毒空斑实验结果显示：空白组、阳性对照组和实验组的病毒空斑数分别为(52.34±12.01)、(20.88±6.47)和(18.25±6.63)个，实验组和阳性对照组的病毒空斑数均显著低于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见图1。

表1川楝素(TSN)对HCT116细胞活性的影响(x¯±s)

表2 TSN对柯萨奇病毒A16型(CA16)感染的HCT116细胞活性的影响(x¯±s)

4川楝素对HCT116细胞VP1和SCARB2表达的影响

蛋白质印迹结果显示：空白组、阳性对照组和实验组的VP1蛋白相对表达水平分别为1.87±0.14、0.77±0.11和0.74±0.09,SCARB2蛋白相对表达水平分别为0.96±0.13、0.26±0.10和0.23±0.09。实验组和阳性对照组的上述指标均显著低于空白组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见图2。

图1 TSN对CA16复制能力的影响

图2川楝素对HCT116细胞对病毒结构蛋白VP1和清道夫受体B2(SCARB2)表达的影响

三、讨论

川楝素是川楝子的主要药效成分，其能够在体内和体外抑制癌细胞的增殖并诱导其凋亡，凋亡的机制涉及线粒体途径和死亡受体途径，同时川楝素也被认为是导致药物不良反应的主要物质[6]。川楝子提取物成分复杂，各类成分的作用并不十分明确。有研究发现，川楝子提取物对流感病毒H3N2有抑制作用，但并未明确是何种成分起到作用[6,7]。但也有研究证实，川楝子提取物通过影响病毒进入、诱导RNA聚合酶复合物PA蛋白和Mx1等途径抑制甲型流感病毒感染，且能通过抑制病毒复制和细胞病变效应来对抗甲型流感病毒[8,9]。但这同样只是证实了川楝子提取物有抗病毒功效，并未证实到具体成分。本研究通过CCK-8实验发现，50μg·mL-1川楝素对HCT116无细胞毒性，且能抑制CA16在细胞内的复制。

CA16是小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是手足口病的主要致病源，严重威胁全球儿童的健康，但是CA16导致手足口病和神经系统疾病的发病机制目前尚未有系统的研究报道[10]。目前，针对CA16感染主要通过注射抗体，但仍然没有CA16特异性的治疗性药物上市，相关的药物研究工作也仅限于临床前研究，这使得医药工作者对治疗由CA16感染引起的重症束手无措[11]。此外，上市的肠道病毒71型疫苗可以预防肠道病毒71型的感染，并不能对易感人群提供针对CA16的完全保护[12]。在治疗CA16感染重症患者时缺乏特异性的治疗药物，只能用核苷酸广谱抗病毒药物以DNA多聚酶为靶点抑制CA16在患者体内的复制，例如利巴韦林、更昔洛韦等[10]。SCARB2又称溶酶体整体膜蛋白Ⅱ(lysosomal integral membrane proteinⅡ,LIMPⅡ)、溶酶体表面蛋白(LGP85)、CD36b like-2,属于CD36家族，其是由478个氨基酸组成的Ⅲ型双跨膜蛋白，在氨基端和羧基端具有较大的外表面结构域和较短的胞质结构域。SCARB2参与内膜转运和内体/溶酶体隔室重组，是CA16的脱衣壳受体[13],广泛地表达于人体各种组织细胞，其在细胞中高表达可以显著增强病毒复制，也可介导细胞内吞作用导致CA16进入宿主细胞质[14]。SCARB2是唯一已知的在CA16感染中具有3个重要功能的受体：病毒结合、内化和开始脱壳。因此，病毒必须利用其他附着受体来实现有效的感染。本研究结果发现，感染CA16的HCT116细胞经川楝素干预后，能明显地抑制CA16的复制，且蛋白质印迹结果发现，SCARB2表达水平明显下调。VP1是确定肠道病毒基因分型的主要依据，一般用VP1的表达量来反映CA16含量[13]。本研究结果发现，经川楝素处理过的HCT116细胞，SCARB2表达水平显著下降，从而导致成功进入细胞内的CA16病毒量减少。

因此，川楝素在质量浓度低于50μg·mL-1时，对HCT116细胞几乎没有细胞毒性；且川楝素能通过降低HCT116细胞中SCARB2的表达水平，进而抑制CA16进入细胞，从而起到抗病毒作用，这为川楝素作为抗病毒药物使用提供了理论依据。

参考文献:

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会手足口病诊疗指南(2018年版)[J].中国病毒病杂志,2018,8(5):347-352.

[3]朱文兵,董少忠,手足口病相关肠道病毒A型单克隆中和抗体综述[J].生命科学, 2020,32(10):1040- 1046.

[5]董育新,吴文君植物杀虫剂毒理学研究新进展[J].昆虫知识,1997,34(2):112-116.

[8]李海波,马森菊,石丹枫,等川棟子的化学成分､药理作用及其毒性研究进展[J].中草药, 2020,51(15):4059-4074.

基金资助:湖州市科学技术局基金资助项目(2018GYB81);

文章来源:邱晔,沈翠芬.川楝素对柯萨奇病毒A16型体外抑制效应的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(15):2184-2187.DOI: