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星形胶质细胞活化在颅脑损伤认知障碍中的作用

2024-11-11 101 上传者：管理员

摘要：目的探讨星形胶质细胞活化在颅脑损伤（TBI）认知障碍中的作用机制。方法将正常SPF级雄性大鼠随机分为对照组、假手术组和模型组，每组10只。对照组不接受外科干预；假手术组仅开骨窗未损伤硬脑膜；模型组在制作骨窗后，用脑损伤仪进行撞击。选取敲除胶质纤维酸性蛋白（GFAP）基因和GFAP过表达的大鼠各10只，处理方式同模型组，设为敲除组和过表达组。用改良神经功能量表（mNSS）评估神经功能，用Morris水迷宫试验评估逃避潜伏期，用实时荧光定量聚合酶链反应法检测星形胶质细胞中GFAP的表达水平，用免疫组化法检测星形胶质细胞的阳性表达情况。结果对照组、假手术组、模型组、敲除组和过表达组的mNSS评分分别为0、0、（9.60±1.17）、（15.20±1.55）和（12.00±1.33）分，第7天的逃避潜伏期分别为（16.15±2.48）、（16.98±2.35）、（40.72±5.42）、（75.42±8.59）和（47.23±6.04）s,星形胶质细胞阳性表达个数分别为（1 264.60±135.45）、（1 289.20±132.29）、（3 269.10±189.39）、（103.90±11.09）和（5 301.50±236.29）cell·mm-2;对照组、假手术组、模型组和过表达组的GFAP基因表达水平分别为0.86±0.02、0.92±0.04、1.37±0.07和3.42±0.07。过表达组的上述指标与对照组、假手术组、模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 TBI会造成认知障碍，影响大鼠认知和记忆能力，GFAP基因与星形胶质细胞的活化有关，有助于修复神经损伤。

关键词：
GFAP
星形胶质细胞
水迷宫试验
逃避潜伏期
颅脑损伤
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颅脑损伤(traumatic brain injury, TBI)可能会导致长期的认知、情感和神经功能障碍[1]。星形胶质细胞对维持大脑环境稳定、调控神经递质转运和细胞内外平衡至关重要[2]。近年来，研究者逐渐认识到星形胶质细胞的活化在TBI后神经细胞的调控中起着核心作用[3]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)作为星形胶质细胞的标志蛋白，其表达上调被视为星形胶质细胞活化的确切标志[4]。本研究旨在探索星形胶质细胞活化在TBI后认知障碍中的作用机制，为TBI的治疗提供新的理论基础和实验依据。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性大鼠、GFAP基因敲除大鼠及GFAP过表达大鼠，鼠龄7周，体质量(220±10)g, 北京科兴生物制品有限公司提供。动物许可证号：SYXK(京)2019-0053。本实验经沧州市中心医院动物伦理委员会批准[伦理批号：2022-054-01(Z)]。

试剂活性氧(reactive oxygen species, ROS)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)、腺苷三磷酸/腺苷二磷酸(adenosine triphosphate/adenosine diphosphate, ATP/ADP)检测试剂盒，均购自上海碧云天生物技术有限公司；GFAP、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)、载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)抗体，均购自南京欧凯生物公司。

仪器ST-3ND脑立体定位仪，上海康威公司产品；Morris水迷宫装置、DigBehv动物行为分析系统，均为上海吉量软件公司产品；RX50荧光显微镜，北京悦昌行科技有限公司产品；CG实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，杭州晶格科学仪器有限公司产品；PowerPac-Basic电泳仪，美国伯乐公司产品。

2 实验方法

2.1 动物分组与处置方法[5]

将SPF级雄性大鼠随机分为对照组、假手术组和模型组，每组10只。对照组不接受外科干预；假手术组大鼠在氯胺酮麻醉下，仅开骨窗未损伤硬脑膜；模型组在假手术组的基础上，额外施加脑损伤。术后对生命体征进行监测，死亡大鼠予以替换。另取GFAP敲除和过表达的大鼠各10只，干预方法与模型组相同，分别设为敲除组和过表达组。脑损伤操作方法如下：在前囟点与人字点之间中央矢状面旁2 mm处开骨窗，用脑损伤仪对开窗处进行单次直径5 mm、深度2 mm、持续500 ms的脑组织撞击。

2.2 神经功能评分量表评估神经损伤情况

于建模后第14天，用改良神经功能评分(modified neurological severity score, mNSS)[6]评定大鼠的神经功能。当大鼠在某个任务中的表现不正常或某个反射消失时，会得到1分。总得分越高表示大鼠的神经功能损伤程度越重。

2.3 Morris水迷宫试验评估空间记忆能力[7]

定位航行造模完成后第14天，所有大鼠在水迷宫内进行适应性训练3 d。训练后的第1、3、7天，大鼠在水池中自由游泳1 min适应环境后，从4个象限的不同点释放，寻找隐藏在东北象限的透明平台。每只大鼠每天进行4次测试，每次从不同象限开始，记录大鼠登陆平台的时间。

空间探索去除水下平台，大鼠从不同象限入水，自由游泳60 s, 共进行4次测试。记录大鼠在原平台象限的停留时间和穿越次数。在原隐藏平台对角位置放置一个露出水面的平台，让大鼠从4个不同象限放入水中，记录到达平台的时间和游泳速度。

2.4 实时荧光定量PCR法检测GFAP、MMP-9和ApoE的表达水平[8]

取大鼠海马组织，用Trizol试剂盒提取组织的总RNA,用逆转录PCR试剂盒合成cDNA。以Cyclin A为内参，通过实时荧光定量PCR分析GFAP、MMP-9和ApoE的表达水平。

2.5 蛋白质印迹法检测GFAP、MMP-9和ApoE蛋白的表达水平

将海马组织100 mg, 剪碎后加入裂解液，制成匀浆。取匀浆液与抽提试剂混合，室温静置后，离心取上清液，用BCA法测定蛋白上清液浓度。取蛋白20～30 μg, 按文献[9]的方法进行操作，以β-tubulin为内参蛋白，用Image J软件计算目的蛋白的灰度值。

2.6 荧光法检测ROS水平、化学比色法检测SDH活性、发光法检测ATP/ADP比率[10]

制备海马组织单细胞悬液，用荧光探针测量ROS水平，用比色法评估SDH活性，用发光试剂测定ATP/ADP比率，以评估细胞能量状态。

2.7 免疫组化检测星形胶质细胞的阳性表达情况

制备海马组织50 μm切片，用0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)冲洗，于4 ℃下孵育兔抗GFAP抗体(1∶200) 24 h, 用Alexa Fluor 488标记的二抗(1∶600)室温孵育3 h。用PBS冲洗切片后封片，在荧光显微镜下观察GFAP阳性细胞，用Image J软件测量阳性细胞密度(cell·mm-2)

3 统计学处理

用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，组间比较用单因素方差分析，对方差齐性组间用Tukey’s HSD检验，方差不齐时，用Games-Howell测试进行两两比较。

二、结果

1 5组大鼠mNSS评分的比较

模型组为正常SPF级雄性大鼠，施加脑损伤；敲除组为GFAP敲除大鼠，施加脑损伤；过表达组为GFAP过表达大鼠，施加脑损伤；对照组为正常SPF级雄性大鼠，不接受外科手术干预；假手术组为正常SPF级雄性大鼠，仅开骨窗未损伤硬脑膜。

对照组、假手术组、模型组、敲除组和过表达组的mNSS评分分别为0、0、(9.60±1.17)、(15.20±1.55)和(12.00±1.33)分，模型组的mNSS评分均显著高于对照组和假手术组，过表达组的mNSS评分均显著高于对照组、假手术组和模型组，敲除组的mNSS评分均显著高于另外4组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2 5组大鼠水迷宫实验结果的比较

模型组训练后第1、3和7天的逃避潜伏期均显著高于对照组和假手术组，象限停留时间和穿越平台次数均较对照组和假手术组显著减少(均P<0.05);过表达组训练后第1、3和7天的逃避潜伏期均显著高于对照组、假手术组和模型组，象限停留时间和穿越平台次数均较对照组、假手术组和模型组显著减少(均P<0.05);敲除组训练后第1、3和7天的逃避潜伏期均显著高于另外4组，象限停留时间和穿越平台次数均显著低于另外4组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);5组大鼠到达平台时间和游泳速度相比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。结果见表1。

3 5组大鼠海马组织中GFAP、MMP-9和ApoE基因表达水平的比较

敲除组海马组织中MMP-9、ApoE基因表达水平均显著低于另外4组，模型组海马组织中GFAP、MMP-9、ApoE基因表达水平均显著高于对照组和假手术组，过表达组海马组织中GFAP、MMP-9、ApoE基因表达水平均显著高于对照组、假手术组和模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。

表15组大鼠逃避潜伏期、空间记忆能力和游泳速度比较

表25组大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、载脂蛋白E(ApoE)基因和蛋白表达水平的比较

4 5组大鼠海马组织中GFAP、MMP-9和ApoE蛋白表达水平的比较

敲除组海马组织中MMP-9、ApoE蛋白相对表达水平均显著低于另外4组，模型组海马组织中GFAP、MMP-9、ApoE蛋白相对表达水平均显著高于对照组和假手术组，过表达组海马组织中GFAP、MMP-9、ApoE蛋白相对表达水平均显著高于对照组、假手术组和模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2和图1。

5 5组大鼠细胞中ROS、SDH和ATP/ADP比率的比较

模型组的ROS水平均显著高于对照组和假手术组，SDH活性和ATP/ADP比率均显著低于对照组和假手术组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);过表达组和敲除组的ROS水平、SDH活性和ATP/ADP比率比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);敲除组的ROS水平显著高于另外4组，SDH活性和ATP/ADP比率均显著低于另外4组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表3。

6 5组大鼠星形胶质细胞阳性表达的情况

对照组、假手术组、模型组、敲除组和过表达组中星形胶质细胞阳性细胞个数分别为(1 264.60±135.45)、(1 289.20±132.29)、(3 269.10±189.39)、(103.90±11.09)和(5 301.50±236.29)cell·mm-2,模型组的星形胶质细胞阳性细胞个数均显著高于对照组和假手术组，过表达组的星形胶质细胞阳性细胞个数均显著高于对照组、假手术组和模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1用蛋白质印迹法检测5组大鼠海马组织中GFAP、MMP-9和ApoE蛋白的表达情况

表35组大鼠活性氧(ROS)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和腺苷三磷酸/腺苷二磷酸(ATP/ADP)比率的比较

三、讨论

TBI可以引发持续神经功能损伤。星形胶质细胞作为中枢神经系统关键成分，对神经环境稳定起核心作用[11]。CHANG等[12]研究显示，TBI后星形胶质细胞活化，对损伤区域进行修复。GFAP是维持星形胶质细胞结构完整性的关键结构蛋白，敲除后会削弱星形胶质细胞对神经损伤的响应。GFAP可以促进星形胶质细胞活化的过程，这种活化状态使星形胶质细胞能够对损伤区域形成一种保护性的屏障，限制损伤的扩散，同时促进损伤区域的清理和修复。本研究结果显示，模型组的mNSS评分均显著高于对照组与假手术组，逃避潜伏期均较对照组和假手术组显著延长，在原平台区的驻留时间及穿越频次均较对照组和假手术组显著减少，表明TBI大鼠出现认知与空间记忆障碍。另外，本研究结果显示，各组到达平台时间及游泳速度上均无显著性差异，这说明TBI对基础运动影响有限。

LIU等[13]研究显示，假手术组大鼠星形胶质细胞中MMP-9表达水平为20.1±0.4,显著低于在TBI大鼠挫伤周围区域中的表达水平(34.4±2.4),说明MMP-9表达水平升高可能与脑部损伤有关。JACKSON等[14]研究发现，星形胶质细胞中ApoE表达的增加，会上调MMP-9的表达，并影响血脑屏障的完整性。本研究结果发现，在敲除GFAP后，MMP-9和ApoE的表达同时降低，说明星形胶质细胞的代谢状态和稳定性的改变也会对MMP-9和ApoE产生影响。GFAP上调虽然会加强星形胶质细胞对神经元的支持作用，但过度表达也会导致神经胶质瘢痕形成加剧，所以本研究中过表达组的应激指标更高，且认知功能低于模型组。此外，模型组、敲除组和过表达组的ROS水平升高，也说明了TBI后氧化应激的增加可能会导致脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质改变，从而破坏细胞结构，对认知功能产生影响。

本研究提示：TBI后会激活星形胶质细胞维护血脑屏障的完整性，发挥神经保护作用。若星形胶质细胞无法有效响应神经损伤，可能会加剧神经炎症反应，从而导致损伤的加重。

参考文献:

[1]刘诸敏,雷丹,卢武,等.乌司他丁联合依达拉奉治疗重症颅脑损伤患者的临床疗效及对神经功能的影响[J].中国临床药理学杂志,2023,39(2):164—167.

[2]袁庆,郭利琛,张彤,等.基于神经血管单元探讨脑卒中生物标志物的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2023,39(15):2261—2265.

[7]周娇洁,刘书婷,徐广民.布比卡因对发育期大鼠认知功能和海马神经元毒性的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(6):565—569.

基金资助:河北省医学科学研究课题基金资助项目(20232116);

文章来源:梁新,李佳庆,王玉保,等.星形胶质细胞活化在颅脑损伤认知障碍中的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(21):3119-3123.