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茶多酚促进周围神经损伤修复的效果

2020-08-08 310 上传者：管理员

摘要：目的：研究茶多酚促进周围神经损伤修复的效果。方法：成年BALB/c小鼠48只，随机分为茶多酚治疗组、生理盐水组及假手术组，每组16只。前两组制备右侧坐骨神经夹伤模型后每天以灌胃法给药，假手术组仅暴露右侧坐骨神经但不做其它处理。术后14d通过足印分析检测小鼠患肢的运动功能，针刺法检测感觉功能；随后每组6只小鼠取坐骨神经提取RNA进行qPCR检测，其余10只小鼠的坐骨神经用于制备NF-200和MBP免疫组化显示再生轴突与髓鞘；其腓肠肌称湿重后制备HE染色切片。结果：相对于生理盐水组，茶多酚治疗组的运动及感觉功能检测指标均有改善；腓肠肌湿重比及肌纤维平均横截面积的提高具有统计学意义；损伤神经的远端再生轴突及髓鞘也有提高。结论：茶多酚能改善由神经损伤所致的行为学功能丧失以及神经病理改变。

关键词：
周围神经损伤
外科
神经再生
茶多酚
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周围神经损伤约占所有创伤的2.8%[1]，可导致患区的感觉与运动功能障碍。周围神经损伤后有一定的再生能力但修复速度很慢，是临床治疗的难点[2,3]，故加快神经再生是当前研究热点。茶多酚是从茶叶中提取的一类多酚类化合物。大量研究表明，茶多酚具有较高的药用价值，诸如抗氧化、抗炎、调控细胞凋亡、抗肿瘤、抗辐射以及心血管保护作用[4,5]。近年发现，茶多酚对神经系统疾病具有一定的防治作用[6]，在神经退行性疾病如阿尔兹海默症和帕金森病中通过抗氧化、铁螯合、抑制α-突触核蛋白聚集和调节细胞内信号通路等机制发挥神经保护作用[7,8]。茶多酚还可以作为巨噬细胞、血管内皮细胞等许多细胞自噬的激活剂而调控细胞凋亡[9,10]。此外还有报道称，成年大鼠静脉注射茶多酚的一种主要成分-没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）能够改善急性和慢性脊髓损伤模型大鼠的神经系统功能[11]。然而，目前研究仅表明茶多酚对中枢神经系统疾病有防治作用，茶多酚是否对周围神经损伤有修复功能仍未明确。为此，本课题组制作坐骨神经夹伤小鼠模型，通过灌胃方式连续给药14d，然后采用运动和感觉行为学检测、组织学检测和qPCR等技术检测茶多酚对神经损伤后肢功能与形态结构修复的效果。

1、材料与方法

1.1主要实验材料

雄性BALB/C小鼠48只，体质量20～23g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（动物合格证编号：SCXK（湘）2016-0002）。茶多酚购于河南锦义生物科技有限公司。小鼠抗大鼠NF-200单克隆抗体、兔抗大鼠MBP多克隆抗体购自美国Sigma公司。Alexa488荧光标记驴抗兔二抗、Alexa568荧光标记驴抗小鼠二抗购自美国lifetechnologies公司。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Gelatinfromcoldwaterfishskin购自美国Sigma公司。CM1950恒温冰冻切片机、正置荧光显微镜（LeicaDM4000B）购自德国莱卡公司。

1.2动物模型的制备及分组

BALB/C雄性小鼠随机分为茶多酚治疗组、生理盐水组和假手术组，每组16只。茶多酚治疗组和生理盐水组制作右侧坐骨神经损伤模型：小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉后，无菌条件下暴露右侧坐骨神经，距梨状肌下缘约0.5cm处，用血管夹夹闭坐骨神经持续1min至被钳夹的神经节段如一透明薄膜。在夹伤节段近端用黑色手术线打一结做标记，打结以不压迫坐骨神经又不易滑脱为原则。依次缝合肌肉和皮肤。模型动物术后第2d起连续14d灌胃，给予1%茶多酚（400mg·kg-1·d-1,2次/日，每次约4ml），或等剂量的生理盐水。假手术组仅暴露神经但不做其它处理。

1.3检测项目

1.3.1行为学检测

术后14d，将带刻度的玻璃凹槽（120cm×30cm×l5cm）水平架空放置。距玻璃槽下方45cm处放置数码相机以录制小鼠步态视频。将待检测小鼠右后肢足掌涂上无毒颜料置于玻璃凹槽内，训练其走窄通道，待其适应并自由行走后录制其步态视频。要求小鼠行走方向为直线，至少走10～20个连续步态。首先分析小鼠损伤侧肢体的着地方式，由于损伤后神经功能的恢复程度不同，可呈现出拖行、足跟着地以及全足掌着地等步态。得到完整足印后测量并记录足掌与前进方向的夹角，即为检测小鼠的运动功能恢复情况。

然后将待测小鼠放置于一方形网格上，针刺小鼠的损伤侧足掌。以小鼠的右足跟与其无名趾尖做一连线，标记5个等距针刺点。通过观察针刺小鼠右后肢足掌的反射跳动进行评分，足跟记为1分，趾尖记为5分，从而对小鼠的感觉功能恢复情况作出评估。

1.3.2组织学检测

腓肠肌湿重比：小鼠行为学检测完毕后，腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）进行麻醉。麻醉后迅速取各组小鼠右侧腓肠肌，擦干血迹称重，计算湿重比：湿重比=损伤侧腓肠肌湿重/假手术组腓肠肌平均湿重。称重后将腓肠肌浸泡于4%多聚甲醛固定液中，后期行石蜡切片HE染色，检查小鼠肌肉的萎缩情况。

腓肠肌组织学检测：取腓肠肌中段5mm×2mm×2mm组织块浸入多聚甲醛过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋切片，所有肌组织横切，厚度4μm。隔5张取1张组织切片行HE染色，光镜观察，采用ImageProPlus图像分析系统测量200倍视野下各组腓肠肌纤维平均面积。

小鼠坐骨神经HE染色：取损伤神经脊髓远端2mm坐骨神经组织石蜡包埋后切片，切片厚度为20μm，每10张切片取1张行HE染色，观察各组小鼠再生神经数量及髓鞘化程度，免疫荧光检测轴突与髓鞘的再生情况。

1.3.3施万细胞分化水平检测

取各组小鼠坐骨神经进行RNA提取，根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在冰盒中配制反应液，体积为10μL。将上述反应混合液采用实时荧光定量PCR检测各组神经Pou3f1(5'-TTCAAGCAACGACGCATCAA-3'）、Jun(5'-GTGTGGGACGACGATCAAAAG-3'）、Notch1(5'-TTGGGAGGAGCAGATTTTTG-3'）、Sox2(5'-GGGACACTTGGCATTACTTCA-3'）、Hmgcr(5'-AGAGCGAGTGCATTAGCAAAG-3'）、Mpz(5'-GCTGACTTGCACATTCGATTCT-3'）、Egr2(5'-GCCAAGGCCGTAGACAAAATC-3'）和Prx(5'-CAGTGGAAGGGATCTAAGAGTGG-3'）基因的表达量。反应条件为：94℃预变性5min,94℃变性15s,50～65℃退火15s,68℃延伸20s，共40个循环。

1.4统计学处理

采用SPSS24.0软件进行统计学分析；呈正态分布的计量资料以均数±标准差表示。对两组间比较采用Student-T检验；对多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1行为学检测

术后14d，各组小鼠皮肤切口甲级愈合。行为学检测发现，假手术组小鼠足迹均为全足掌着地，针刺评分为（5±0）分，说明手术对其感觉与运动功能几无影响；茶多酚治疗组小鼠的运动及感觉功能都有一定的恢复，优于生理盐水组，但与假手术组相比有一定的差距。

2.1.1运动功能恢复情况

术后14d各组小鼠的运功功能都有一定恢复。小鼠足迹与其前进方向的夹角检测，假手术组、生理盐水组、茶多酚治疗组分别为（4.72±0.75）°、（11.03±1.04）°、（19.89±3.45）°，各组间差异具有统计学意义（P<0.01，图1A）。步态完整程度检测，假手术组小鼠均为全足掌着地，茶多酚治疗组集中表现为足跟着地及全足掌着地，而生理盐水组大部分处于拖行步态。除茶多酚治疗组与生理盐水组拖行步态无统计学意义外（P>0.05），其余组间对比均有统计学意义（P<0.01，图1B）。以上结果提示，茶多酚治疗组小鼠运动功能恢复优于生理盐水组。

2.1.2感觉功能恢复情况

术后14d针刺各组小鼠损伤侧足掌发现，假手术组针刺得分最高，为（5±0），茶多酚治疗组针刺得分为（3.31±1.14），高于生理盐水组针刺得分（2.06±1.28），各组间的差距具有统计学意义（P<0.01，图1C），以上结果提示茶多酚治疗组小鼠感觉功能恢复优于生理盐水组。

图1行为学检测统计图

2.2腓肠肌萎缩情况检测

术后14d，对比各组腓肠肌萎缩情况发现，模型小鼠由于靶区肌组织失去神经支配而发生失神经性萎缩。生理盐水组腓肠肌萎缩严重，而茶多酚治疗组腓肠肌萎缩程度相对较轻（图2D）。腓肠肌HE染色观察发现，生理盐水组小鼠肌纤维萎缩严重，假手术组无萎缩，茶多酚治疗组小鼠腓肠肌萎缩程度介于二者之间（图2A,B,C）。定量统计比较发现，茶多酚治疗组小鼠腓肠肌湿重比及腓肠肌纤维横切面积比率分别为60.39%、81.1%，远高于生理盐水组的34.87%,38.40%，组间差异具有统计学意义（P<0.01，图3A,B）。

图2各组腓肠肌纤维形态

图3各组腓肠肌湿重比及腓肠肌纤维横切面积比率图

2.3神经HE染色及免疫荧光染色

造模小鼠的损伤侧神经及髓鞘被完全夹闭。14d后，各组小鼠的神经轴突会有不同程度的再生。坐骨神经HE染色定性分析结果提示假手术组小鼠神经的神经轴突数量最多且髓鞘化程度最高；茶多酚治疗组相较于生理盐水组，轴突数量更多，排列更整齐，轴突直径更大，束间空隙较小，髓鞘化程度更高（图4）。坐骨神经轴突横、纵切面NF-200图可以发现，茶多酚治疗组小鼠的神经轴突阳性表达率与假手术组有一定差别，但明显要高于生理盐水组。坐骨神经髓鞘横切面MBP图显示茶多酚治疗组小鼠的再生髓鞘阳性表达率同样优于生理盐水组。横切面的免疫荧光双染NF-200和MBP显示，茶多酚治疗组小鼠坐骨神经部分红色NF的外围有绿色MBP，表明轴突外围有髓鞘包裹，其髓鞘化程度低于假手术组，但显著高于生理盐水组（P<0.01）（图5）。

图4各组坐骨神经轴突及髓鞘HE染色图A：假手术组B：茶多酚治疗组C：生理盐水组

图5各组坐骨神经免疫荧光染色图

2.4施万细胞去分化水平检测

神经损伤后髓鞘崩解，施万细胞开始去分化回归幼稚的施万细胞并增殖。待炎症反应消退，轴突再生之后施万细胞会逐渐迁移分化并形成新的髓鞘包裹轴突。因此检测施万细胞的分化水平可以推断神经再生的效果。14d后检测各组小鼠的施万细胞不同分化标志物的mRNA水平，可以看出茶多酚治疗组小鼠的施万细胞分化水平高于生理盐水组，差异有统计学意义（P<0.01）（图6,7）。

图6各组小鼠施万细胞分化程度对比图

图7各组小鼠施万细胞去分化程度对比图

3、讨论

本实验为茶多酚促进急性小鼠坐骨神经损伤模型后感觉与运动功能的恢复提供了证据。术后14d，通过针刺、步态与前进方向的夹角以及小鼠步态百分比对小鼠的行为学进行检测从而评价小鼠的感觉与运动功能的恢复情况。结果显示，茶多酚治疗组小鼠的各项行为学数据均明显优于生理盐水组（P<0.01），提示茶多酚治疗组小鼠的感觉与运动功能都有不同程度的恢复。而以上的结果与前人研究结果相似。最近有研究表明动物腹腔注射EGCG(60mg·kg-1·d-1），可提高由奥沙利铂诱导的周围神经病变动物的感觉异常性疼痛和热阈值[23]；同样，长期口服EGCG由于减少了大鼠体内3,4-甲氧基安非他明（MDA）和亚硝酸盐的含量，增加红细胞超氧化物歧化酶的活动从而降低由链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠神经性痛觉过敏([19]。

当周围神经损伤后，靶区肌组织会因为失去神经支配而发生失神经性萎缩，

肌肉重量及肌纤维横截面积会出现不同程度的减小：当神经再生并重新支配相应肌肉后，上述情况才能获得改善。因此，检测靶区肌组织的结构也是评价神经损伤与再生的重要指标之一[24]。在以往的研究中，关于茶多酚抑制肌肉失神经性萎缩的修复鲜有报道。本实验通过腓肠肌湿重比以及腓肠肌纤维的横切面积比从宏观与微观层面对小鼠的肌肉萎缩情况进行对比分析。从各组腓肠肌湿重图与各组腓肠肌纤维横切面图中可以发现茶多酚组小鼠腓肠肌萎缩相较于生理盐水组更轻。从腓肠肌湿重比与腓肠肌肌纤维横切面比率的定量分析数据同样可以发现，茶多酚组小鼠的腓肠肌湿重比与腓肠肌肌纤维横切面比率分别为0.811，远高于生理盐水组的0.384，差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果均提示茶多酚对周围神经损伤靶肌肉的萎缩具有一定抑制作用。

目前的研究认为，周围神经的损伤主要是神经轴突的损伤和髓鞘的崩解，而周围神经的修复也主要是轴突的再生和髓鞘的重新形成，因此对再生轴突及其髓鞘化程度的检测是评价神经恢复的重要指标。本研究通过神经组织HE染色、免疫荧光染色以及qPCR检测施万细胞分化水平对各组小鼠的再生神经轴突及其髓鞘化程度进行定性分析。从神经横切面HE染色图中可以发现茶多酚治疗组小鼠的再生轴突数量及髓鞘化程度优于生理盐水组，而免疫荧光染色图中发现茶多酚治疗组小鼠的再生轴突及髓鞘的阳性表达率明显优于生理盐水组。同样的，茶多酚治疗组小鼠的施万细胞分化成熟的程度也明显优于生理盐水组。以上结果可以证明，茶多酚对周围神经损伤的神经病理改变具有修复作用。

综上所述，本研究显示茶多酚能改善由神经损伤所致的行为学功能丧失以及神经病理改变，同时还提示茶多酚可作为潜在的神经保护药物用于周围神经损伤后的功能恢复。然而本研究仅仅表明使用400mg·kg-1·d-1的茶多酚灌胃对周围神经损伤的功能修复具有促进作用，至于茶多酚作用的最佳剂量仍然需要进一步探索。关于茶多酚发挥神经保护功能的具体机制尚不明确，推测可能跟茶多酚抗氧化及抗炎作用密切相关。后续实验将研究茶多酚作用于周围神经损伤的具体机制，并设定阳性对照组与临床常用药物进行对比，还可以初步尝试联合临床药物对周围神经损伤进行干预，观察其对周围神经损伤修复的效果。

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基金:湖南省教育厅优秀青年项目(16B245);郴州市科技项目(CZ-XNXY201509);大学生研究性学习与创新性实验项目(湘南学院校发[2018]147号).