肺缺血-再灌注损伤是肺组织经过一段时间缺血后,再恢复血液灌注时触发一系列复杂级联反应导致肺损伤进一步加重的病理生理过程。临床上常发生于肺移植、体外循环、创伤、心肺复苏等过程中。其特征是强烈的无菌性炎症,微血管通透性增加,肺泡细胞损伤,进而导致肺水肿形成,氧合功能受损和肺动脉高压。LIRI是影响手术成功率和患者生存率的重要因素,是医学领域亟待解决的问题。

缺氧的多数反应由缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)的转录因子家族引起,该因子诱导多种基因的表达,这些基因帮助细胞适应低氧环境。近年来对HIF的研究越发深入,其与缺血缺氧性疾病的关系也逐渐被揭露,许多研究显示HIF在氧化应激、炎症、糖酵解以及细胞自噬等复杂机制中起着重要作用。因此,本文就HIF与LIRI的关系作一综述。

1、HIF概述

1.1HIF的结构

HIF是由α、β两个蛋白质亚基组成的异二聚体转录因子,目前为止已经发现的HIF家族成员包括HIF-1、HIF-2和HIF-3,其中HIF-1α和HIF-2α在结构上最相似,也最具特征性,HIF-3α以多重剪接变异体的形式存在,其中一些以显性负性方式抑制HIF-1α和HIF-2α的活性。HIF-1α,HIF-2α和HIF-3α是活性和功能亚基,为氧调节性蛋白,它们的结构具有相似性,都是碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)-PAS(Per-ARNT-Sim,PAS)转录因子超家族成员,含有bHLH-PAS结构域、氧依赖性降解结构域、抑制结构域和反式激活域。HIF-1β是结构性亚基,在细胞核中稳定表达,不受氧浓度影响,HIF-α亚基与HIF-1β结合形成相应的HIF家族成员。

1.2HIF的表达与调控

HIF-1α在所有细胞中普遍表达,而HIF-2α和HIF-3α在某些组织中选择性表达,包括血管内皮细胞,Ⅱ型肺泡上皮细胞,肾间质细胞,肝实质细胞和骨髓谱系细胞[1]。HIF-α水平受多因素调控。在转录水平上,多种细胞因子,磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K),miRNA[2]等可以调节HIF-α的水平。转录后降解阶段分为氧依赖性和非氧依赖性调控。常氧时,ODDD中的脯氨酸残基(P402/P564)被脯氨酸羟化酶羟基化[3],此外,ODDD中的一个赖氨酸残基(K532)可以被乙酰转移酶(arrestdefective1,ARD1)乙酰化。因此,当P402/P564被羟基化、K532被乙酰化后,HIF-1α亚基会优先被希佩尔-林道(VonHippel-Lindau,VHL)肿瘤抑制基因表达蛋白识别,进而被泛素化并且经蛋白酶体途径降解。由于PHD和ARD1的作用都需要氧的存在,所以在缺氧条件下,HIF-1α脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化和乙酰化都不发生,HIF-1α降解减少,导致HIF-1α水平增高。与PHD相似,HIF-1抑制因子(factor-inhibitingHIF-1,FIH-1)羟基化HIF-1中的天冬酰胺残基(A803)来负性调控HIF转录活性(见图1[4])。非氧依赖性调控中,去铁胺、氯化钴等可减少HIF-α亚基的降解,增加细胞内HIF-α亚基的累积。

在氧合良好的细胞中(红色箭头;右侧示意图),HIF-α亚基分别通过PHD和FIH-1将特定的脯氨酸和天冬酰胺残基羟基化。羟基化反应以O2和α-酮戊二酸为底物,生成CO2和琥珀酸为副产物。脯氨酸羟基化的HIF-α亚基被VHL识别,VHL招募BCCRE2复合物,导致HIF-α亚基的赖氨酸残基多泛素化,继发HIF-α亚基的靶向蛋白酶体降解。HIF-α亚基反式激活区天冬酰胺残基的羟基化阻止了协同激活子p300和CREB结合蛋白的募集。在低氧细胞(蓝箭头;示意图左侧),羟基化反应被抑制,导致HIF-α亚基的积累,其与HIF-1β二聚,招募协同激活子,并与位于靶基因内或接近靶基因的低氧应答元件中的共有序列5’-(A/G)CGTG-3’结合,从而激活它们的转录。

1.3HIF的功能

已知HIF能调控下游超过200个靶基因的表达,其功能亦是涉及许多生物学方面。缺氧条件下,HIF通过上调编码血管内皮生长因子A的基因来促进血管生成,亦能动员和募集骨髓源性血管生成细胞以应对组织缺血[5]。HIF在维持氧稳态中占据重要地位[6],其与活性氧(reactiveoxygen,ROS)之间有密切而复杂的联系,帮助器官和组织抵抗氧化应激,减轻氧化损伤[7]。此外,HIF还与炎症和免疫系统关系紧密,当免疫细胞缺氧时,激活的HIF在调节免疫细胞的存活和分化,控制促炎因子的表达等方面发挥了重要作用[8]。

图1HIF-α的调控

2、LIRI概述

近年来认为,LIRI是一种快速而复杂的炎症反应,包括内皮细胞和上皮细胞损伤和功能障碍、细胞因子和损伤相关分子模式释放,以及强烈的固有免疫反应,其中包括激活肺泡巨噬细胞、恒定型自然杀伤T细胞和中性粒细胞。目前认为LIRI的发生可能与以下机制有关:①强烈的氧化应激损伤。血流停止时,血管内皮细胞膜去极化激活作为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶之一的非吞噬细胞氧化酶2,产生大量ROS,导致细胞和组织损伤、多种类型细胞的激活、细胞膜脂质过氧化反应,以及促炎细胞因子和损伤相关分子模式的分泌等[9];②炎症途径。在肺缺血再灌注后,固有免疫细胞激活、浸润,特别是中性粒细胞,其作为组织损伤的末端效应器的事实已被充分证实[10];③内皮细胞功能障碍和内皮屏障破坏;④细胞凋亡[9];⑤基因突变[11]。此外,转录因子核因子κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB),信号传导及转录激活蛋白3信号通路,Toll样受体4(Toll-likereceptors4,TLR4)的激活[9]等也参与了LIRI。这些机制形成错综复杂的信号网络共同发挥作用,促进LIRI的发生发展。

3、HIF与LIRI

3.1HIF减轻氧化应激损伤

HIF是维持机体氧化还原稳态的关键,在缺氧情况下HIF可将细胞从氧化代谢转换为糖酵解,从而减少线粒体超氧化物的产生,避免LIRI后ROS剧增导致的氧化应激损伤,另一方面HIF直接和间接地提高了抗氧化剂还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成,最终在低氧条件下维持氧化还原稳态。2019诺贝尔生理学或医学奖得主Gregg.L.Semenza,同时也是HIF-1的发现者,在2017年综述了HIF是如何在低氧状态下维持氧化还原稳态的[7]。①HIF-1通过减少乙酰辅酶A的合成抑制ROS的产生。低氧条件下,HIF-1激活丙酮酸脱氢酶激酶1,导致丙酮酸脱氢酶磷酸化和失活,阻止了丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。除葡萄糖氧化代谢外,脂肪酸氧化是乙酰辅酶A的另一产生途径,HIF-1可以通过下调长链及中链酰基辅酶A脱氢酶的C-MYC依赖性表达来减少脂肪酸氧化,从而减少乙酰辅酶A的合成。②HIF促进抗氧化剂的产生,从而调节缺氧细胞的抗氧化防御。还原型GSH是人体细胞中的主要抗氧化剂,并且需要NADPH才能将GSH维持在正常状态。在缺氧条件下,HIF激活磷酸甘油酸脱氢酶,磷酸丝氨酸转氨酶1和磷酸丝氨酸磷酸酶的转录,以增加葡萄糖向丝氨酸的转化,丝氨酸是GSH合成的必需氨基酸,其含量增加可以提高GSH水平;同时HIF会激活丝氨酸羟甲基转移酶2,亚甲基四氢叶酸脱氢酶2和亚甲基四氢叶酸脱氢酶1样的转录以增加线粒体NADPH的生成。有趣的是,研究发现只有HIF-1激活可以通过减少乙酰辅酶A的合成来抑制ROS产生,而HIF-1和HIF-2的激活都可以促进GSH生成。③HIF-1通过调节线粒体选择性自噬来抑制缺氧细胞中ROS的产生。线粒体是产生ROS的主要细胞器,BCL2/腺病毒E1B的19kDa结合蛋白3(BNIP3)和BNIP3L分别在小鼠胚胎成纤维细胞和癌细胞中的HIF-1依赖性表达,可以刺激线粒体选择性自噬,抑制葡萄糖和脂肪酸的氧化,从而降低了低氧条件下ROS的产生。

高浓度的ROS会导致蛋白质、脂质和DNA的不可逆氧化,导致细胞死亡,具有细胞毒性作用,HIF通过以上多种机制减少缺氧时ROS的产生,从而保护细胞。Liang等[12]在大鼠肺缺血再灌注实验中证实,缺血再灌注后白介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子-α、IL-10、IL-1水平明显升高而右美托咪定可以降低上述分子的表达水平。另外,该实验还证实右美托咪定预处理后丙二醛和髓过氧化物酶活性明显降低,表明氧化应激损伤减轻。此外,该实验还显示右美托咪定可以上调HIF-1α、蛋白激酶B的表达并证实右美托咪定预处理可通过激活PI3K/Akt/HIF-1α信号通路在转录水平上减轻氧化应激损伤,提高机体抗氧化能力,从而减轻LIRI。此外,研究[13]表明在脑缺血再灌注损伤诱导的肺损伤过程中,机体可以通过激活红系衍生的核因子2相关因子/血红素氧合酶1和HIF-1α/VEGF信号通路提高抗氧化应激活性并促进血管生成,维护和修复肺泡-毛细血管上皮屏障,从而实现自我保护。

3.2HIF与炎症

HIF在各种炎症条件下的作用并不相同,不同炎症疾病中HIF作用不一样,甚至是相反的,在某些炎症疾病中促炎,而在其他炎症疾病中发挥抗炎作用[14]。虽然到目前为止已有许多关于HIF在LIRI发生发展过程中对炎症作用机制的研究,但在HIF总体上是发挥促炎作用还是抗炎作用的问题上仍存在一定的争论。Keränen等[15]为了研究HIF-1α激活和失活对缺血再灌注损伤和急性排斥反应的影响,建立了髓系细胞HIF-1α或其负性调节因子VHL靶向缺失的转基因小鼠模型,并分别进行同种异体心脏移植手术。结果是,在体外,VHL-/-髓系细胞中抗炎基因吲哚胺2,3-双加氧酶、精氨酸酶1和血红素氧合酶1的mRNA表达增强,在体内,移植受体的VHL-/-髓系细胞中缺血再灌注损伤和急性排斥反应明显减轻,该实验结果提示,髓系细胞中HIF的基因或药理学激活可能是一种新的治疗策略,可以调节实体器官移植后的固有免疫反应,从而调节适应性免疫反应,最终减轻移植器官炎症反应和缺血再灌注损伤,保护移植器官。但是Jin等[16]却得出了相反的结论,他们在大鼠肺缺血再灌注组中证实水飞蓟素可能通过抑制HIF-1α/诱导型一氧化氮合酶信号通路改善LIRI后的肺血管功能障碍。对于HIF-2α,则有研究显示在原位气管移植模型中,激活HIF-2α可以促进气道微血管完整性,从而减少中性粒细胞浸润,减轻同种免疫性炎症[17]。见图2,

图2HIF-1α/炎症/氧化应激网络

HIF-1α与炎症、氧化应激关系密切,三者形成了错综复杂的反馈网络[9,18]。举例来说,LIRI过程中产生的氧化应激会加剧TLR4的激活,TLR4是炎症通路的关键调节因子,同时TLR4-HIF-1α之间的前馈环维持着炎性信号传导[18]。ROS和慢性炎症都可以激活转录因子NF-κB,导致染色质重塑和促炎介质基因的表达[9],而NF-κB已被证明与HIF-1α有协同作用,可以稳定并增强HIF-1α的转录活性,并协同激活IL-6,环加氧酶2,iNOS2等炎性介质基因启动子[18]。此外,目前已知IL-1、IL-2、IL-1β、TNF-α、前列腺素E2及脂多糖等致炎性细胞因子能激活HIF-1α的转录活性,更确切地提示了这三者间的密切关系。目前仍然有许多机制尚不明确,针对HIF-α/炎症/氧化应激网络治疗LIRI仍存在许多问题,比如,HIF稳定剂和HIF抑制剂,哪种治疗效果更好,不良反应更少?如果靶向HIF-α是有益的,那么应该靶向特定的HIF-α同工型还是两种同工型?这些都是未来临床应用中需要解决的问题。

3.3HIF刺激血管生成和血管重塑

增加局部O2输送的主要手段是血管生成(新血管的形成)和血管重塑(增加现有血管的管腔直径)。为了响应缺血和缺氧,HIF通过上调编码分泌性血管生成生长因子和细胞因子的多种基因的转录,刺激内皮细胞的增殖和BMDACs的募集,发挥主调节因子的作用[6]。在一项试验[4]中,研究者向8个月大野生型小鼠的缺血肢体肌肉注射重组腺病毒AdCA5,纠正了小鼠的血流恢复障碍,该重组腺病毒编码活化构型的HIF-1α,对O2依赖性降解具有抗性。与VEGF基因疗法不同,HIF-1α的过度表达增加了血液灌注,却没有增加血管通透性,这意味着靶向HIF-1α疗法不会增加中性粒细胞浸润和炎性损伤。在另一项相关研究[19]中,以17个月大患有重症肢端缺血小鼠为模型,单纯注射AdCA5不能纠正其血管损伤,肢体挽救即完全恢复而无组织损伤比例为0%,但若先注射AdCA5,24小时后再静脉注射用HIF-1α稳定剂二甲基草酸甘氨酸(dimethyloxallylgly-cine,DMOG)预处理的BMDACs,其肢体挽救比例为40%。后续研究证实,HIF-1α稳定剂处理有两个益处:第一是HIF-1α诱导整合素β2,介导BMDACs黏附到缺血组织血管内皮细胞上;第二是HIF-1α使BMDACs从氧化代谢转变为糖酵解代谢,增加了其在缺血环境中的存活率[20]。以上研究结果提示了自体骨髓疗法很可能对LIRI也具有治疗效果,可以改善肺组织的缺血缺氧情况。最近,Jiang等[17]证明HIF-2α通过激活血管生成素-1/酪氨酸激酶受体2信号通路和受体Notch活性维护气道微血管完整性,在原位气管移植中,HIF-2α过表达延长了移植物微血管的灌注,减轻了缺血-再灌注损伤。

3.4HIF保护内皮细胞屏障功能

内皮细胞功能障碍和内皮屏障破坏是LIRI的标志,对原发性移植物功能障碍的发生有重要作用。Ge等[21]用LIRI小鼠为模型,以野生型小鼠和水通道蛋白1(aquaporin1,AQP1)缺失小鼠作对照,发现在LIRI后的7～14天,野生型小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonarymicrovascularendothelialcells,PMVEC)中AQP1表达显著增加,而AQP1缺失小鼠相比于野生型小鼠,白细胞浸润、胶原沉积和微血管通透性显著增强,并且血管生成因子的表达也被明显抑制。同时AQP1缺失降低了HIF-2α的稳定性、PMVEC的活性和毛细血管的形成,提高了PMVEC的通透性,而HIF-2α的过度表达则可部分降低PMVEC的通透性,表明AQP1通过稳定HIF-2α表达起到保护内皮细胞屏障的功能,参与了长期LIRI的消退。此外,Zhao等[22]证明HIF-1α参与肺缺血再灌注后肺血管功能障碍,HIF-1α稳定剂DMOG通过iNOS/NO途径减轻LIRI诱导的内皮细胞功能障碍,具有明显的保护作用。

3.5HIF通过细胞凋亡等其他途径参与LIRI

在缺氧条件下,HIF-1α能协同激活PI3K/Akt信号通路,通过抑制胱冬肽酶家族活性来调节缺血-再灌注诱导的细胞凋亡。已有研究[21]显示,用右美托咪定预处理LIRI大鼠可以使HIF-1α表达水平升高,激活被抑制的PI3K/Akt信号通路,从而减少细胞凋亡,减轻长时间LIRI。Wu等[23]已经研究发现,积雪草酸能通过调节miR-1290/HIF-3α/HIF-1α轴保护心肌细胞免受缺氧诱导的凋亡,HIF-3α是HIF-1α的负性调节因子,其mRNA是miR-1290的潜在靶点,积雪草酸可上调miR-1290的表达,降低HIF-3α对HIF-1α的负性调节作用,提高HIF-1α活性从而起到保护心肌细胞的作用。此外,腺苷的HIF依赖性生成[24]也是参与LIRI的重要环节。胞外ATP通过外核苷酸酶CD39转化为一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate,AMP),5'-AMP核苷酸酶CD73催化AMP合成腺苷。缺氧诱导CD39和CD73以HIF依赖性的方式使细胞外腺苷水平升高,同时缺氧抑制腺苷激酶和腺苷脱氨酶的活性,导致细胞内腺苷水平升高。腺苷水平升高会激活A2腺苷受体,已有研究[25]证明A2腺苷受体激动剂可以显著减轻LIRI,其介导保护功能的主要机制是抑制恒定型自然杀伤T细胞中的非吞噬细胞氧化酶2,减少ROS和IL-17A产生,减轻氧化应激损伤和中性粒细胞浸润导致的炎性损伤。

4、总结与展望

HIF生物学功能复杂,与多种信号通路和细胞因子相联系,通过多种途径参与LIRI的发生发展,目前已经有许多以HIF为靶点治疗LIRI的实验,比如上文提及的HIF-1α稳定剂DMOG在实验中显示了对肺明显的保护作用,以及右美托咪定和积雪草酸,都成功地通过调节HIF途径减轻了LIRI,这些药物都有在未来成为临床防治LIRI常用药物的可能性。然而,HIF参与LIRI的具体机制及其相互联系尚未完全明确,因此需要继续探索其相关性,同时解决临床应用问题,比如说,治疗LIRI应该靶向特定的HIF同工型还是两种同工型,怎么样特异性靶向PMVEC和髓系细胞中的HIF,这些都是未来将要面对的问题和挑战。

参考文献：

[1]刘铭月,吉冰洋.缺氧诱导因子在深低温停循环肠保护机制中的研究进展[J].中国体外循环杂志,2016,14(3):182-184.

缺氧诱导因子在肺缺血-再灌注损伤中的研究进展