心力衰竭是心血管疾病的最后阶段,已对全球公共卫生构成巨大威胁[1,2]。尽管过去几十年在治疗方面取得了进展,但心力衰竭的患病率仍在继续增加[3,4]。心力衰竭具有极其复杂的病理生理机制,目前指南中推荐的药物如血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂和螺内酯,往往直接针对有限的分子和途径,这些药物的联合使用往往是为了达到更好的效果,但同时也会造成较高的医疗负担和副作用,增加病人的经济负担[5,6]。因此,探讨潜在的治疗心力衰竭策略是非常必要的。

中医方剂为慢性心力衰竭提供了多种治疗选择,益气活血颗粒(Yiqihuoxuegranules,YHG)由中医经典方剂(LingGuiZhuGanDecotion,LGZGD)加减而来,陈苏宁教授治疗慢性心力衰竭(CHF)有多年临床经验,在苓桂术甘汤经典方之上加黄芪、丹参、赤芍三味中药,均取得良好疗效。现代研究也证明,丹参、黄芪、赤芍均具有保护心脏的作用。丹参注射液可预防心肌纤维化、心肌肥厚、血流动力学恶化以及收缩期和心脏功能衰竭的舒张功能障碍[7]。黄芪注射液作为临床上广泛应用的专利药物,具有增强心肌收缩力、改善循环、保护心肌细胞、调节免疫等作用。此外,黄芪注射液中发现的活性成分对缺血缺氧心肌细胞也具有保护作用[8]。黄芪口服液有助于改善慢性心力衰竭心肌纤维化病人的心功能和血管炎症[9]。从赤芍中提取的赤芍总苷经现代药理研究证实其具有抗凝血、抗血栓、改善微循环、保护心脏缺血等药理作用[10]。

1、资料与方法

1.1资料

中药系统药理学数据库及分析平台(TraditionalChineseMedicineSystemsPharmacologyDatabaseandAnalysisPlatform,TCMSP.http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php,Version:2.3);蛋白序列数据库UniProtkb(https://www.uniprot.org/);蛋白序列数据库DisGeNET(https://www.disgenet.org/);蛋白质相互作用网络(STRINGDatabase,https://string-db.org/,Version:11.0);作图软件CytoscapeSoftware,version3.7.1;基因功能富集分析平台(DAVID6.8https://david.ncifcrf.gov/、CTD,http://ctdbase.org/);韦恩图(venny2.1,https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html);网络分析软件NetworkAnalyzer(ClueGO,CluePedia)。

1.2方法

1.2.1收集潜在的活性成分并预测其目标

口服生物利用度(OB)和药物相似度(DL)是药物研发中评价药物活性成分的两个重要参数,分别反映了药物在人体中的吸收和分布,这些成分可与现有药物的相似性以及预证明开发药物的可能性。因此,在OB>30%和DL>0.18的条件下,从TCMSP中筛选出益气活血颗粒的有效活性成分及其对应的靶标(TCMSP数据库中的靶标数据来源于DrugBank数据库)[11],将获得的目标物输入到UniProt数据库中,利用UniProt知识库(UniProtkb)将蛋白名转化为基因名。

1.2.2筛选作用靶标

在DisGeNET数据库中,进入首页,点击search,选择disease,输入疾病名“CHF”并点击搜索,取得与该疾病相关的“基因”。将药物靶点和疾病靶点输入Venny2.1,取交集,获取药物-疾病交集靶点,上述靶点被认为是益气活血颗粒治疗慢性心力衰竭的作用靶点,然后将交集靶点的“基因名”输入STRINGDatabase数据库,利用其“Multipleproteinssearch”工具,将得到的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)关系,以tsv格式保存为文件。

1.2.3构建“药物-成分-作用靶点”网络和PPI网络

将作用靶点及其对应的活性成分及其相关药材输入到Cytoscape软件中,构建“药物-成分-靶点”网络。另外,将上述tsv格式文件中“node1”“node2”“combinescore”栏信息加载到Cytoscape软件中,得到初始PPI网络。利用工具网络分析仪对其进行分析,主要关注其统计结果之一的节点自由度(Degree),根据Degree编辑最终的网络并将其导出到图像中。

1.2.4进行基因本体(GO)功能与京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析

利用DAVID6.8数据库来丰富GO功能,包括分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞成分(CC),也可用该数据库研究KEGG通路;用CluePedia编辑网络,使其能够显示作用靶点和途径之间的联系;同时,根据需要手动筛选节点。

2、结果

2.1益气活血颗粒的潜在活性成分及其相关靶点

在TCMSP中分别输入茯苓、桂枝、白术、炙甘草、丹参、黄芪、赤芍7味中药,在OB>30%和DL>0.18的条件下,筛选出223种有效成分,包括丹参酮ⅡA、山柰酚、槲皮苷、十八烯酸、柚苷配基、谷固醇、糖甙、甘草素C、鳞叶甘草素A、7-邻甲基异亮醇、常春藤皂苷元、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、黄芩素、二氢丹参内酯等3429个靶点,其中茯苓15种、桂枝7种、白术7种、甘草92种(炙甘草/甘草)、丹参53种、黄芪20种、赤芍29种,剔除重复目标后,共有321个靶点。详见表1。

表1益气活血颗粒有效活性成分数量

在UniProt数据库中,使用搜索引擎“UniProtKB”,经过“reviewed(Swiss-Prot)”和“Human”过滤,输入获得的321个靶点并逐一检查,最终,只有297个靶点名称被成功转化,这些靶点均与慢性心力衰竭相关,都是通过在CTD中查找与该疾病相关的“基因”而被命名为作用靶点。

2.2构建网络

有297个预测靶标和慢性心力衰竭有关,包括TNF、MAPK1、IL-6、BCL-2、JUN、RELA、STAT3、MMP、TP53、Caspase等,将297个作用靶点输入STRINGDatabase数据库,将organism设置为“Homosapiens”,点击“SEARCH”,构建初始PPI网络。

将297个作用靶点对应的活性成分及其相关药材导入Cytoscape软件,构建药物-成分-靶点网络(见图1),将297个化合物靶点(297个化合物靶点输入Venny2.1软件,只有292个靶点被显示)与73个慢性心力衰竭靶点基因取交集,得到16个交集基因(见图2)。并将初始PPI网络及其combinedscores导入Cytoscape软件。根据16个交集靶点的Degree构建最终的PPI网络(见图3)。

图1益气活血颗粒的“药物-成分-作用靶点”网络

图2慢性心力衰竭靶点基因交集

图3药物成分-疾病交集基因网络图

2.3分析网络

益气活血颗粒的药物-成分-作用靶点网络图1中,浅蓝色尖角形节点代表茯苓活性成分,紫色菱形节点代表桂枝活性成分,红色平行四边形节点代表白术活性成分,绿色三角形节点代表甘草活性成分,黄色多边圆形节点代表丹参活性成分,橙色六边形节点代表黄芪活性成分,深蓝色正方形节点代表赤芍活性成分。共包含407个节点和3037条边。天蓝色椭圆节点表示297个作用靶点,边表示活性成分与作用靶点之间的关系。

2.4GO功能和KEGG通路富集分析

2.4.1GO功能富集分析

应用DAVID6.8丰富苓桂术甘加减汤的297个药物作用靶点的GO功能,选择“Homosapiens”,共有285个基因被识别,点击DISEASE选项,显示10个与之相关的疾病,包括心肌梗死、酒精依赖、高血压、痴呆、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、疟疾、乳腺癌等。详见图4。

GO分析结果分别为GO-BP生物学过程、GO-CC细胞组分和GO-MF分子功能。GO-BP富集含有135条,它们参与调节细胞的增殖、生长和凋亡;基因转录与表达;蛋白质合成、活化和分解;能量使用;交感神经和副交感神经传输的调节具有抗氧化保护、调节免疫系统、血管生成、内皮细胞增生作用。GO-CC富集含有7条,包括细胞外空间、细胞外区域、质膜外侧面、胞质的核周区、早幼粒细胞白血病体、核周体、受体复合体。GO-MF富集含有13条,包括细胞因子活性、蛋白质异源二聚体活动酶结合、蛋白质同源二聚化活动、相同的蛋白结合、去甲肾上腺素结合、肾上腺素结合、蛋白结合、核心启动子序列特异性DNA结合、蛋白磷酸酶绑定、p53绑定、蛋白酶绑定、Ras鸟苷核苷酸交换因子活性。按照P值取前5条,并作图统计。详见图5。

图4GO功能富集分析的相关疾病

图5GO分析过程

2.4.2KEGG通路富集分析

将16个交集靶点输入David6.8,得到KEGG通路共33条,与炎症相关的通路主要有TNF信号通路和HIF-1信号通路;与神经体液有关的因素主要有细胞因子受体相互作用和钙信号通路。此外,在ClueGO中输入16个交集靶点来丰富GO函数(仅BP,使用GOTermFusion,P≤0)。KEGG通路的富集显示了每个通路中作用靶点的位置,潜在的活性成分通过影响这些靶点的表达或功能来影响通路的整体功能。详见图6。

图6KEGG通路富集分析图

2.4.3基于心力衰竭发病机制分析

益气活血颗粒加减方的分子机制,益气活血颗粒加减方药物-成分-作用靶点网络体现了中医药治疗慢性心力衰竭多成分(潜在有效成分)和多靶点的特点(见图1),GO功能的丰富反映了作用靶点自身及其在人体多个部位连接的重要功能,包括细胞及其生存环境(见图5)。

有研究表明,炎症系统的过度激活和炎症细胞因子的过度释放加速了慢性心力衰竭的病理生理过程,导致心室重构和负性肌力作用[12]。白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在慢性心力衰竭病人中活跃,导致左心室容积和压力增加,心功能受损,加重慢性心力衰竭[13],慢性心力衰竭病人在很长一段时间内处于相对缺血状态,导致IL-6和TNF-α的过度生成和分泌,恶化心脏收缩性。

沉寂信息调节因子(silentinformationregulator1,Sirt1)是调控细胞寿命的关键基因,在许多方面具有心脏保护作用,它参与基因沉默、细胞衰老、细胞分化和细胞存活[14],提示Sirt1可能在衰老过程中发挥重要作用,并与心肌细胞的死亡和生存有关。体外研究发现,内源性Sirt1在介导心肌细胞存活中发挥了重要作用:Sirt1的过表达对心肌细胞凋亡具有保护作用,而Sirt1的下调可能与凋亡细胞有关[15]。在体心脏模型、离体Langendorff模型或体外培养的心肌细胞均有研究表明,Sirt1通过调节凋亡抑制、延缓衰老、减轻氧化应激等作用,对心血管应激具有保护作用[16]。

内皮素-1被认为是许多疾病的致病标记,已知在冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、糖尿病和高血压以及心力衰竭发生发展中发挥重要作用[17],循环中的内皮素-1水平在心力衰竭时升高,预测预后不良[18]。内皮素-1对心脏组织有多种生物学作用,内皮素通过冠状血管收缩影响心脏功能,内源性内皮素-1可能参与多种心血管疾病的进展,内皮素拮抗剂目前临床上用于治疗肺动脉高压病人,被认为有进一步的靶疾病如心力衰竭、心肌肥厚等心脏疾病、肾脏疾病、全身性高血压、脑血管痉挛等[19]。

基质金属蛋白酶(MMPs)在心力衰竭的发病机制中起重要作用,心肌细胞外基质(ECM)是心脏结构和生理稳态的基础动态环境,ECM稳态的改变可能导致舒张或收缩功能障碍,从而导致心力衰竭,对于ECM的降解,MMPs起作用。与心力衰竭相关的最常分析的MMPs为MMP-2和MMP-9,其循环水平可以作为心力衰竭病人治疗效果的指标,也可以作为通过改变MMPs通路来确定哪些病人可以从特定的治疗干预中获益[20]。

RNA测序结果显示,经氧化还原处理的小鼠心脏中血红素氧合酶-1(Hmox1)显著上调。可诱导的血红素氧合酶1在氧化还原酶诱导的心脏损伤中被Nrf2的核转位上调,催化血红素降解,促进游离铁的释放,导致铁中毒,最终导致心力衰竭[21]。

3、讨论

心力衰竭是一种复杂的临床综合征,以心功能受损和/或结构异常引起的心输出量减少和/或心内充盈压力升高为典型体征和症状,也是一个主要的公共卫生问题,在美国每年大约有91.5万人新发心力衰竭病例被诊断,不论男女,心力衰竭的发病率均随年龄增长而增加[22,23]。有研究表明,苓桂术甘汤对慢性心力衰竭治疗有效,薛经纬等[24]通过观察136例心力衰竭病人显示,参附汤合苓桂术甘汤能降低慢性心力衰竭病人脑钠肽水平,提高心功能,临床治疗效果较佳,在慢性心力衰竭临床治疗上有益。杨建华等[25]治疗72例心力衰竭病人,发现桂枝赤芍方能改善心力衰竭病人血流动力学,较西药常规治疗有效,并且能提高病人的生活质量。丹参酮能抑制心肌氧化应激水平,改善心力衰竭大鼠心肌纤维化水平[26]。中西医结合治疗益气活血利尿是治疗心力衰竭的有效方法。

网络药理学是以系统生物学为基础,结合多向药理学,通过构建多个网络,阐述药物、分子、靶点、疾病和通路之间的关系,从更全面的角度解释中药处方的分子机制,这也与中医学治疗疾病的整体观是一致的。因此,本研究应用网络药理学对益气活血颗粒治疗慢性心力衰竭的分子机制进行初步探索,为其深入研究、进一步开发应用提供思路。

中药方剂具有临床疗效,但其改变人体病理状态的分子机制尚未揭示。通过网络药理学可以直观地看到益气活血颗粒对机体分子的综合影响,根据当前对慢性心力衰竭发病机制的研究和疾病分子变化进程分析,进一步探讨益气活血颗粒对细胞的影响及其环境,提供一个初步的分子机制探索治疗慢性心力衰竭的处方。

本研究显示,益气活血颗粒可能通过IL-6、TNF、HMOX1、EDN1、MMP2等关键靶点影响慢性心力衰竭的治疗过程。本研究在预测297个目标的基础上,通过16个疾病-药物交集基因,得到了它们之间的相互作用、GO功能和KEGG通路富集;并进一步分析和推断益气活血颗粒的分子机制,为后续医学实验证明该分子机制提供思路与指导,将在以后的实验中加以验证。

参考文献：

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[10]董国菊,刘剑刚,张庆翔,等.活血解毒中药组分配伍对急性心肌梗死后缺血心肌病理形态和心功能的影响[J].环球中医药,2015,8(11):1340-1345.

[14]李珊.Sirt1对缺血再灌注损伤心肌的保护作用及信号通路机制研究[D].西安:第四军医大学,2016.

[24]薛经纬,居励之.参附汤合苓桂术甘汤对慢性心衰患者脑钠肽､左室射血分数的影响[J].中医临床研究,2019,11(27):35-36.

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