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外周血线粒体DNA与慢性心力衰竭病情的关系

2021-04-05 174 上传者：管理员

摘要：目的：探讨外周血线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)与慢性心力衰竭（chronicheartfailure,CHF）病情及近期预后的关系。方法：选取2018年1月至2020年1月承德医学院附属医院收治的130例CHF患者作为研究对象（CHF组），根据CHF患者出院3个月内是否发生不良心血管事件分为预后不良组（36例）和预后良好组（94例），另选取同期健康体检者80例作为对照组。检测入组对象外周血mtDNA的表达水平，收集临床资料及相关实验室指标，logistic回归分析CHF患者预后的相关因素，使用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC）评估mtDNA对患者预后不良的预测价值。结果：CHF组患者外周血mtDNA的表达水平明显高于对照组，差异有显著性（P<0.05）。预后不良组患者外周血mtDNA、氨基N末端B型利钠肽前体、左心室舒张末期内径、左心室收缩末内径、纽约心脏病协会（NewYorkHeartAssociation,NYHA）分级明显高于预后良好组，而左心室射血分数明显低于预后良好组，差异均有显著性（P<0.05）。CHF患者外周血mtDNA的表达水平与NYHA分级、氨基N末端B型利钠肽前体、左心室舒张末期内径、左心室收缩末内径呈明显正相关，而与左心室射血分数呈明显负相关（P<0.05）。Logistic多因素回归分析显示，mtDNA(OR=1.789)、NYHA分级（OR=3.049）是CHF患者预后不良的危险因素，而左心室射血分数（OR=0.634）是其保护因素（P<0.05）。ROC曲线分析显示，外周血mtDNA预测CHF患者预后不良的AUC为0.852(P<0.001)，敏感度和特异度分别为81.15%、77.24%。结论：CHF患者外周血mtDNA的表达水平明显升高，可较好地反映患者病情严重程度，且对患者近期预后不良具有较高的预测价值，可为CHF的诊治及预后改善提供指导。

关键词：
慢性心力衰竭
病情严重程度
线粒体DNA
预后
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慢性心力衰竭（chronicheartfailure,CHF）是以体/肺循环淤血、器官血供不足为主要临床表现的综合征，亦是各种心血管疾病的终末期，其发病率及病死率较高，严重威胁患者的生活质量及生命安全[1]。积极寻找可准确评估CHF病情及预后的生物学标志物对于改善患者预后至关重要。外周血线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA）是人体内的游离DNA之一，可实时反映机体新陈代谢情况，与机体的生理及病理状态密切相关[2]。近年来，大量研究证实心肌梗死、心脏停搏、严重创伤、脓毒血症等危重症患者血浆中mtDNA明显升高，可作为疾病诊断及预后监测的有效标志物之一[3,4]。CHF患者心肌缺血严重，心肌内的线粒体存在损伤及功能障碍[5]，可能导致外周血mtDNA水平发生变化，此种变化可能与CHF的进展相关。本研究探讨外周血mtDNA与CHF病情及近期预后的关系，以期为临床治疗提供帮助。

1、资料与方法

1.1研究对象

选取2018年1月至2020年1月承德医学院附属医院收治的CHF患者130例作为研究对象（CHF组），其中男80例，女50例，年龄45～81岁，平均（61.24±5.29）岁。纳入标准：(1)CHF的诊断标准及入院治疗方法均参考《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》[6];(2)近1个月内未行输血治疗；(3)未进行过化疗、放疗。排除标准：(1)重度瓣膜病、肥厚或限制性心肌病、缩窄性心包炎、心源性休克、急性心肌梗死等疾病；(2)严重肝功能、肾功能不全；(3)恶性肿瘤、结缔组织病、线粒体相关疾病；(4)妊娠期或哺乳期。另选取同期健康体检者80例作为对照组，其中男性47例，女性33例，年龄43～80岁，平均（60.08±5.37）岁。CHF组与对照组年龄、性别差异无显著性（P>0.05）。入组患者均签署知情同意书，本研究获得承德医学院附属医院伦理委员会的审批同意。

1.2一般资料

收集入组对象的性别、年龄、体重指数（bodymassindex,BMI）、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、纽约心脏病协会（NewYorkHeartAssociation,NYHA）心功能分级等资料。使用超声心动图仪（PHILIPSHD11，飞利浦）检测并记录心功能相关指标，包括左心室射血分数（leftventricularejectionfraction,LVEF）、左心室舒张末期内径（leftventricularend-diastolicdiameter,LVEDD）、左心室收缩末内径（leftventricularendsystolicdiameter,LVESD）。

1.3mtDNA及生化指标检测

抽取入组对象晨起空腹静脉血10ml,1h内以800r/min离心10min（离心半径15cm），取上清液分装，后以1200r/min离心10min去除血细胞成分，置于-80℃冰箱中保存。严格按照检测试剂盒操作说明，使用酶联免疫吸附试验检测血清中氨基N末端B型利钠肽前体（NT-proBNP）水平，试剂盒均购于上海钰博生物科技有限公司。使用BK-280型全自动生化分析仪（山东博科生物有限公司）检测血清中肌酐（serumcreatinine,Scr）、总胆固醇（totalcholesterol,TC）、甘油三酯（triacylglycerol,TG）、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein,LDL）、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein,HDL）的水平。严格按照DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）操作说明提取血清中的总DNA，然后使用定量PCR(qRT-PCR）检测入组对象血清中mtDNA的水平。主要步骤包括：采用qRT-PCR扩增仪（上海普迪生物科技有限公司）对mtDNA进行扩增，qRT-PCR反应条件：95℃预变性30s、95℃变性30s、58℃退火30s，共35个循环；72℃延伸50s。建立DNA标准曲线，使用PrimerPrimer5.0软件设计合成目标序列，以2-ΔΔCt法计算拷贝数。

1.4随访

CHF患者出院3个月内通过门诊复查或电话定期随访，了解患者不良心血管事件发生情况。不良心血管事件定义为：致死性心律失常、心源性猝死、心力衰竭复发。未发生不良心血管事件者进入预后良好组，发生者进入预后不良组。

1.5统计学处理

使用SPSS23.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以频数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson/Spearman法，采用logistic回归分析患者预后的相关因素，采用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC）评估mtDNA对患者预后不良的预测价值。P<0.05为差异有显著性。

2、结果

2.1CHF组患者外周血mtDNA表达水平的变化

CHF组患者外周血mtDNA的表达水平为（1.08±0.35）×106，明显高于对照组的（0.41±0.07）×106，差异有显著性(t=16.900,P=0.000）。

2.2CHF组患者不同预后各指标的比较

经随访，130例CHF组患者中预后良好组94例（72.31%），预后不良组36例（27.69%）。预后不良组患者外周血mtDNA、NT-proBNP、LVEDD、LVESD水平及NYHA分级均明显高于预后良好组，而LVEF水平明显低于预后良好组，差异有显著性（P<0.05）。见表1。

表1CHF组患者不同预后各指标的比较

2.3CHF组患者外周血mtDNA表达水平与心功能指标的相关性

CHF患者外周血mtDNA的表达水平与NYHA分级（rs=0.613,P=0.007）、NT-proBNP(r=0.583,P=0.013）、LVEDD(r=0.662,P<0.001）、LVESD(r=0.531,P=0.009）均呈明显正相关，而与LVEF(r=-0.703,P<0.001）呈明显负相关。

2.4CHF患者预后不良的相关因素分析

以CHF患者预后作为因变量（预后不良=1，预后良好=0），以mtDNA（实测值）、NT-proBNP（实测值）、LVEDD（实测值）、LVESD（实测值）、LVEF（实测值）、NYHA分级（Ⅰ级=0，Ⅱ级=1，Ⅲ级=2，Ⅳ级=3）为自变量，建立logistic风险回归模型（进入法），结果显示mtDNA(OR=1.789）、NYHA分级（OR=3.049）是CHF患者预后不良的危险因素，而LVEF(OR=0.634）是其保护因素（P<0.05）。见表2。

2.5外周血mtDNA表达水平对CHF患者预后不良的预测价值

ROC曲线分析显示，外周血mtDNA预测CHF患者预后不良的AUC为0.852(95%CI0.782～0.922,P<0.001），敏感度和特异度分别为81.15%、77.24%，最佳预测值为1.02×106，约登指数为0.584。预测曲线见图1。

表2CHF患者预后不良的相关因素分析

3、讨论

CHF是各种因素导致的心脏结构改变，可引发心室充盈及射血功能受损，进而导致机体供氧不足[7,8,9]。CHF在心血管疾病中所占比重较小，但其病死率较高，本研究随访结果显示CHF患者近期预后不良率高达27.69%，与既往研究相符[10]。CHF是由心室重构、心肌能量代谢障碍、神经体液调节等多种途径共同作用引起的，其中心肌能量代谢障碍诱发的心肌细胞凋亡在CHF发生的作用最为重要。NYHA分级是评估心功能受损程度的可靠指标之一，其分级越高表明心力衰竭程度越严重，患者的转归越差。LVEF是反映左心室射血能力的直观指标之一，其值越高表明心室泵血功能越好，心肌受损越轻，患者的预后亦较好[11]。本研究结果显示，NYHA分级越高，患者预后不良的风险越高，而LVEF值越高，患者预后不良风险越低，此结果亦印证了上述结论。尽管NYHA分级和LVEF在一定程度上反映了CHF的病情及转归，但机体代偿机制的存在可导致患者长期处于缺氧耐受状态，二者的变化相较于心功能受损程度较为滞后，不利于疾病的早期评估及干预[12]。因此，积极寻求准确评估CHF患者病情及预后的新型指标十分必要。

mtDNA是机体细胞内唯一的细胞核外遗传物质，主要存在于线粒体中，健康人外周血中mtDNA含量极低且相对稳定，其水平升高常提示机体处于病理状态[13,14]。本研究结果显示CHF患者外周血mtDNA水平明显升高，与周双艳等[15]证实的急性心肌梗死患者血浆游离mtDNA拷贝数升高有相似之处，均提示外周血mtDNA水平升高与心肌损伤存在联系。本研究中预后不良组患者外周血mtDNA明显高于预后良好组，相关性分析显示CHF患者外周血mtDNA含量与NYHA分级、NT-proBNP、LVEDD、LVESD均呈明显正相关，而与LVEF呈明显负相关，表明随着外周血mtDNA含量升高，CHF患者病情逐渐加重。本研究结果还显示，外周血mtDNA是患者近期预后不良的独立危险预测因子，这也进一步证实了外周血mtDNA是反映CHF患者病情及预后的可靠指标之一。CHF患者心肌缺血缺氧，心肌细胞内超微结构发生改变，线粒体所处外环境遭受破坏，而线粒体作为机体氧化磷酸化反应的中心，其产生的大量氧自由基此时不能通过稳定的外环境进行清除[16]。mtDNA缺乏组蛋白保护，且线粒体内缺乏DNA抗损伤修复系统，导致其更易受到氧自由基的损害，受损的mtDNA通过自吞噬途径降解，进一步导致线粒体内DNA减少，最终引起线粒体呼吸功能丧失[17,18]。线粒体呼吸功能丧失可加速心肌细胞的坏死、凋亡、裂解，进而释放胞内mtDNA，导致外周血mtDNA含量升高[19]。还有报道显示外周血游离的mtDNA可识别人体中性粒细胞表面的Toll样受体，进而促进中性粒细胞Ca2+内流、磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶，此机制加重了中性粒细胞的趋化迁移及脱颗粒化，进而引发全身炎症反应，这亦会加重CHF的病情进展[20]。鉴于此，笔者推测CHF患者外周血mtDNA含量与其病情及预后均具有较好量化关系的原因在于线粒体受损导致的心肌细胞死亡释放了大量mtDNA，且释放的mtDNA通过引发炎症反应进一步加重CHF的进展，以此形成恶性循环。

早期判断病情严重程度及预后是改善CHF患者转归的关键，因此，临床应用的理想标志物应对病情及预后评估具有较高的灵敏度和特异度[21]。本研究使用外周血mtDNA对CHF患者近期预后不良发生情况进行预测，结果显示其预测灵敏度高达81.15%，特异度高达77.24%，提示外周血mtDNA是预测患者预后不良的可靠指标。有基础研究显示循环mtDNA在缺血模型中可持续升高1周，相较于乳酸脱氢酶、肌酸激酶等心肌损伤标志物而言，其有效监测窗口期更长[22]，这也与本研究显示的外周血mtDNA预测CHF患者近期预后不良较高的准确度相呼应。

综上所述，CHF患者外周血mtDNA的表达水平明显升高，可较好地反映患者严重程度，且对患者近期预后不良具有较高的预测价值，可为CHF的诊治及预后改善提供指导。

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