慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)是各种心血管疾病的终末表现，全世界现患病人数约4 000万，我国约有1 370万，再住院率约69%,住院死亡率约4%[1,2,3,4]。心梗后心脏重构是CHF的主要病理基础，也是心血管领域研究的热点与难点[5]。含溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)是病理性心脏重构的主要参与者[6],其参与的病理过程包括心肌细胞肥大、心梗后心衰和血管平滑肌重塑。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是一种细胞能量传感器和代谢主开关[7]。CHF发生时，心肌合成ATP的能力下降[8,9,10],AMPK被激活，活化的AMPK可通过多种途径提高ATP合成和/或减少消耗，使细胞内能量代谢达到平衡[11];CHF发展时，AMPK活性降低[12,13],心肌能量代谢发生障碍。一些研究发现抑制BRD4可激活AMPK[14,15],通过BRD4/AMPK途径改善心肌细胞内能量代谢有望成为治疗CHF的策略之一。

注射用益气复脉(冻干)是由生脉饮衍生而来，主要由红参、麦冬和五味子组成，功效益气复脉、养阴生津，常用于冠心病劳累性心绞痛、慢性左心功能不全气阴两虚证的治疗，但其作用机制尚未完全明确。基于此，本研究采用心梗后心衰小鼠模型和H9C2细胞糖氧剥夺(oxygen and glucose deprivation, OGD)模型，从体内和体外2个层面观察注射用益气复脉(冻干)对CHF的影响，并围绕BRD4/AMPK介导的能量代谢探讨其作用机制。

1、材料

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠30只，8周龄，体质量(20±2)g, 购于北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号SCXK(京)2021-0006],饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房，室温22～24 ℃,相对湿度50%～55%,给予普通饲料喂养。实验方案经上海中医药大学实验研究伦理委员会批准(PZSHUTCM220711039),饲养及处理过程严格按照《实验动物管理和使用指南》进行。

1.2 细胞

H9C2细胞购自大连美仑生物技术有限公司，用含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基培养，置于37 ℃、95% O2、5% CO2的环境中，每2～3 d更换1次新鲜培养液，待细胞长满皿底约80%时，传代或冻存。

1.3 药物

注射用益气复脉(冻干)(批号20220502)购自天津天士力之骄药业有限公司，用生理盐水配制成质量浓度为133.8 mg/mL的溶液；JQ1(BRD4抑制剂，批号HY-78695)购自美国MedChemExpress公司，用无菌PBS配制成浓度为10 nmol/mL的溶液。

1.4 试剂

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(货号C2006)购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清(货号04-001-1ACS)购自以色列Biological Industries公司；ATP含量测定试剂盒(比色法)(货号A095-1-1)购自南京建成生物工程研究所；TUNEL试剂盒(货号G1501)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；BRD4抗体(货号DF2905)、HRP标记山羊抗兔IgG(货号S0001)均购自美国Affinity公司；AMPK抗体(货号66536-1-lg)购自美国Cell Signaling Technology公司；p-AMPK抗体(货号ab133448)购自英国Abcam公司；β-actin抗体(货号CL594-66009)购自美国Proteintech公司。

1.5 仪器

彩色多普勒超声诊断系统(货号VIVID5)购自美国通用电气公司；Nikon Eclipse C1型倒置荧光显微镜购自日本尼康公司；化学发光成像系统(货号4600SF)购自上海天能科技有限公司；ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。

2、方法

2.1 动物分组、造模及给药

30只小鼠随机分为假手术组、模型组、益气复脉组，每组10只。除假手术组外，其余各组小鼠行冠状动脉前降支(LAD)结扎术，具体方法参照文献[16]报道。按人与小鼠体表面积换算等效剂量，益气复脉组每天给予注射用益气复脉(冻干)0.669 g/kg腹腔注射，假手术组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射，连续4周。

2.2 细胞分组、造模及给药

将H9C2细胞分为正常组，OGD组，益气复脉低、中、高剂量组，JQ1组(具体见表1)。H9C2细胞以8×105/mL的密度接种于6孔板中，每孔1 mL,生长至融合度约70%时构建OGD模型[17],即将板中培养基弃去，使用无菌PBS冲洗2次后，正常组加入含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、95% O2、5% CO2的环境中培养12 h; OGD组加入含1%双抗、无胎牛血清的低糖DMEM培养基，益气复脉各剂量组加入含相应质量浓度益气复脉溶液、1%双抗、无胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37 ℃、95% N2、5%CO2的环境中共培养12 h。

表1 H9C2细胞分组

2.3 心功能检测

小鼠麻醉后，行超声观察，计算心脏左室射血分数(LVEF)、左室收缩分数(LVFS)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)。

2.4 心肌组织病理检测

小鼠处死后，收取心脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成3 μm切片，进行HE染色，光镜下观察心肌组织病理形态。

2.5 心肌损伤相关基因表达检测

小鼠心肌组织和经OGD诱导后的H9C2细胞使用TRIzol提取总RNA,使用Hiscript Ⅱ QRT SuperMix将500 ng总RNA合成第一链cDNA。使用ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应，条件为95 ℃预变性30 s; 95 ℃ 10 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 循环40次；熔解曲线反应条件为95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。引物序列见表2,以GAPDH 为内参，采用比较循环阈值(CT)法，通过2-ΔΔCT方法计算目的基因相对表达。

表2 引物序列

2.6 TUNEL染色法检测细胞凋亡率

小鼠心脏经石蜡切片后常规脱蜡，H9C2细胞以8×105/mL的密度接种于底部铺有爬片的6孔板中，每孔1 mL,生长至融合度约70%时，按照“2.2”项下方法构建OGD模型，12 h后取出，弃去培养基，无菌PBS冲洗2次，加入4%多聚甲醛固定。按照试剂说明书进行操作，镜检拍照，计算TUNEL染色阳性率，即为细胞凋亡率。

2.7 线粒体膜电位测定

以每孔8×105个的密度将细胞接种于6孔板中，生长至融合度约70%时，按照“2.2”项下方法构建OGD模型，12 h后取出，弃去培养基，无菌PBS冲洗2次，按照试剂说明书进行操作，于倒置荧光显微镜下检测荧光强度(绿色/红色),计算荧光强度(绿色/红色)比值。

2.8 ATP水平检测

以每孔8×105个的密度将细胞接种于6孔板中，生长至融合度约70%时，按照“2.2”项下方法构建OGD模型，12 h后取出，弃去培养基，无菌PBS冲洗2次，按照试剂说明书进行操作，使用酶标仪在636 nm波长处测量吸光度值，计算ATP水平。

2.9 Western blot法检测小鼠心肌组织和H9C2细胞BRD4、p-AMPK/AMPK蛋白表达

小鼠心肌组织和经OGD诱导后的H9C2细胞经匀浆、裂解、离心后取上清液，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后电泳，转至PVDF膜，1%BSA封闭1 h; 加入BRD4、AMPK、p-AMPK一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，加入HRP标记二抗，室温孵育1 h; TBST洗膜，滴加ECL发光液(A液、B液按1∶1混匀),化学发光成像系统曝光。采用Image J软件获得灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.10 统计学分析

通过SPSS 25.0软件进行处理，服从正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较方差齐用LSD法；不服从正态分布的数据，多组间比较用非参数检验，组间两两比较用成对多重比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心功能的影响

与假手术组比较，模型组小鼠LVEF和LVFS降低(P<0.01),LVIDd和LVIDs升高(P<0.01);与模型组比较，益气复脉组小鼠LVEF和LVFS升高(P<0.05,P<0.01),LVIDd和LVIDs降低(P<0.05,P<0.01),见图1。

图1 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心功能的影响

3.2 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心肌组织病理形态的影响

假手术组心脏大小正常，心肌细胞排列整齐、结构致密；模型组心脏心室壁变薄，左心室腔扩大，心肌细胞排列紊乱扭曲、细胞间隙增加；与模型组比较，益气复脉组小鼠心室腔稍小，心肌细胞排列稍整齐致密，见图2。

图2 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心肌组织病理形态的影响(×200)  

3.3 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠和OGD诱导的H9C2细胞心肌损伤相关基因的影响

与假手术组比较，模型组小鼠心肌组织ANP、BNP、BRD4 mRNA表达升高(P<0.01);与模型组比较，益气复脉组心肌组织ANP、BNP、BRD4 mRNA表达降低(P<0.01),见图3。

图3 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心肌损伤相关基因表达的影响

与正常组比较，OGD组H9C2细胞ANP、BNP、BRD4 mRNA表达升高(P<0.01);与OGD组比较，益气复脉中、高剂量组和JQ1组细胞ANP、BNP、BRD4 mRNA表达均降低(P<0.01),见图4。

图4 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞心肌损伤相关基因表达的影响

3.4 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠和OGD诱导的H9C2细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组小鼠心肌细胞凋亡率升高(P<0.01);与模型组比较，益气复脉组小鼠心肌细胞凋亡率降低(P<0.01),见图5。

图5 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心肌细胞凋亡的影响

与正常组比较，OGD组H9C2细胞凋亡率升高(P<0.01);与OGD组比较，益气复脉各剂量组和JQ1组H9C2细胞凋亡率均降低(P<0.05,P<0.01),见图6。

图6 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞凋亡的影响

3.5 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞线粒体膜电位的影响

JC-1是一种用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)ΔΨm的荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物(aggregates),可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer),产生绿色荧光。与正常组比较，OGD组细胞线粒体膜电位降低(P<0.01);与OGD组比较，益气复脉低、中剂量组和JQ1组细胞线粒体膜电位均升高(P<0.05,P<0.01),见图7。

图7 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞线粒体膜电位的影响

3.6 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞内ATP水平的影响

与正常组比较，OGD组细胞内ATP水平降低(P<0.01);与OGD组比较，益气复脉中剂量组和JQ1组细胞内ATP水平升高(P<0.05,P<0.01),见图8。

图8 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞内ATP水平的影响

3.7 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心肌组织和OGD诱导的H9C2细胞内BRD4、p-AMPK/AMPK蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组小鼠心肌组织BRD4蛋白表达升高(P<0.01),p-AMPK/AMPK表达降低(P<0.01);与模型组比较，益气复脉组小鼠心肌组织BRD4蛋白表达降低(P<0.01),p-AMPK/AMPK表达升高(P<0.05),见图9。

与正常组比较，OGD组细胞BRD4蛋白表达升高(P<0.01),p-AMPK/AMPK表达降低(P<0.01);与OGD组比较，益气复脉中剂量组和JQ1组BRD4蛋白表达降低(P<0.01),p-AMPK/AMPK表达升高(P<0.01),见图10。

4、讨论

CHF属中医“心水”“喘证”等范畴，气阴两虚是CHF最常见的证型，在CHF的各个时期均可出现[18,19]。注射用益气复脉(冻干)主要功效为益气复脉、养阴生津，临床主要用于冠心病劳累型心绞痛及慢性心功能不全等气阴两虚证的心脏疾病的治疗，具有改善患者体征、心脏功能，减轻心肌损伤，提高生活质量的作用[20]。本研究显示，注射用益气复脉(冻干)可以改善心梗后心衰小鼠心功能，减少心肌细胞凋亡，降低心肌ANP、BNP基因表达，体外实验亦看到同样的效果。

CHF主要病理表现是线粒体功能障碍和心肌收缩力下降[21]。CHF发生发展时，心肌细胞能量代谢紊乱，线粒体通透性转换孔持续开放，线粒体功能障碍，ATP合成减少，导致收缩功能障碍[22],进而引起心室重构[23]。AMPK可调控心肌细胞内能量稳态[24]。活化的AMPK在抑制ATP消耗同时刺激葡萄糖的摄取和氧化，改善心室重构[11],激活AMPK可以保护心肌细胞免受炎症和能量耗竭的影响[12],逐渐成为CHF的治疗靶点之一[25,26]。本研究发现，注射用益气复脉(冻干)可以提高心梗后心衰小鼠和OGD诱导的H9C2心肌细胞ATP水平及p-AMPK/AMPK蛋白表达，改善OGD诱导的心肌细胞线粒体膜电位损伤。

BRD4具有调控细胞周期、胚胎发生和稳定基因组的作用[27,28],也是心脏损伤的罪魁祸首之一。急性心梗大鼠BRD4 mRNA及蛋白表达升高[29],抑制BRD4可减少心梗时的心肌细胞凋亡[30]。BRD4蛋白表达增加可介导心肌细胞肥大的发生，在CHF的心室重构中起重要作用[31,32,33]。在BRD4基因敲除小鼠心脏组织中线粒体能量产生和稳态所必需的基因也有所缺失，BRD4的消融引起了线粒体电子传输链蛋白表达和活性的显著变化[6],提示BRD4对细胞内能量代谢亦有重要影响。本实验发现，心梗后心衰小鼠和OGD诱导的H9C2细胞内BRD4 mRNA和蛋白表达均上调；细胞凋亡增加，线粒体膜电位和ATP水平均下降，而经BRD4抑制剂处理后，相关基因及蛋白表达均下调，线粒体膜电位和ATP水平均升高，表明抑制BRD4可减少细胞凋亡减少，改善OGD诱导的心肌细胞线粒体功能障碍，提高细胞内能量的供应。

图9 注射用益气复脉(冻干)对心梗后心衰小鼠心肌组织BRD4、p-AMPK/AMPK蛋白表达的影响

图10 注射用益气复脉(冻干)对OGD诱导的H9C2细胞内BRD4、p-AMPK/AMPK蛋白表达的影

在非心脏研究中发现BRD4和AMPK存在相互作用，抑制BRD4可激活AMPK诱导乳腺癌细胞自噬性死亡、促进小鼠脊髓损伤后功能恢复[14,15]。本实验发现，经BRD4抑制剂处理后，BRD4 mRNA和蛋白表达均降低，p-AMPK/AMPK蛋白表达升高，提示在心衰小鼠心肌组织和OGD诱导的H9C2细胞内，BRD4和AMPK存在相互作用，抑制BRD4可能激活AMPK。经注射用益气复脉(冻干)处理的心衰小鼠及OGD诱导的心肌细胞中，BRD4 mRNA和蛋白表达均降低，p-AMPK/AMPK蛋白表达均升高，与BRD4抑制剂组趋势一致，提示注射用益气复脉(冻干)对心衰心肌的保护作用可能是通过BRD4/AMPK途径来实现的。

参考文献:

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[23]陈绍熠,金艳蓉,柴琳,等.慢性心衰心肌能量代谢中医研究进展[J].中国民族民间医药,2022,31(13):55-58.

基金资助:上海市科学技术委员会重点实验室建设(医疗类)项目(14DZ2273200);上海市科学技术委员会引导类项目(19401934300);上海市卫生和计划生育委员会中医药事业发展三年行动计划项目[ZY(2018-2020)-CCCX-2003-07];上海市临床重点专科(中医心病科)(shslczdzk05301);

文章来源:李湘玲,李益萍,高俊杰.注射用益气复脉(冻干)对心肌梗死后慢性心力衰竭的改善作用[J].中成药,2024,46(05):1483-1491.