首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 原发性高血压论文 > 用UHPLC-MS/MS法测定比格犬血浆中拉西地平的浓度

用UHPLC-MS/MS法测定比格犬血浆中拉西地平的浓度

2024-10-28 48 上传者：管理员

摘要：目的建立一种测定比格犬血浆中拉西地平的超高效液相色谱-串联质谱方法。方法用蛋白沉淀法进行预处理，内标为尼莫地平。色谱柱：ACQUITY UPLC? BEH C8（2.1 mm×50.0 mm, 1.7μm）,流动相：100%水含5 mmol•L-1醋酸铵-100%乙腈，流速：0.7 mL•min-1,柱温：40℃,自动进样器温度：4℃,进样量：20μL。用电喷雾离子化源，正离子模式，多反应监测。考察该方法的专属性、残留效应、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、基质效应、稳定性。结果拉西地平在0.10～50.0 ng•mL-1内线性关系良好，r=0.996 6,定量下限为0.10 ng•mL-1,专属性良好，批内和批间相对标准偏差不超过12%,提取回收率高于80%,稳定性结果良好。结论本方法灵敏度高、操作简单、分析时间短，适用于比格犬血浆中拉西地平的药代动力学研究。

关键词：
原发性高血压
拉西地平
蛋白沉淀
血药浓度
超高效液相色谱-串联质谱法
加入收藏

拉西地平是一种双氢吡啶类钙离子拮抗药[1],用于治疗轻中度原发性高血压，同时具有抗动脉粥样硬化和抗氧化作用[2]。但是该药物肝首过效应显著，生物利用度为2%～9%[3],起效剂量小，导致血药浓度低。本研究用简单的蛋白沉淀方法预处理血浆样品，建立一种灵敏度高且操作简单的液质联用法测定血浆中拉西地平的浓度，并成功应用于比格犬体内的药代动力学研究。

1、材料与方法

1材料

动物6只健康比格犬，犬龄约40周，体质量12～14 kg,由沈阳康平实验动物研究所提供。动物生产许可证号：SCXK(辽)2019-0002;动物使用许可证号：SCXK(辽)2020-0009;本实验经沈阳药科大学实验动物伦理委员会批准(伦理批号：SYPU-TACUL-2023-0830-501)。

药品拉西地平对照品，含量：99.9%,批号：100741-200802,尼莫地平对照品，含量：99.9%,批号：100270-200002,均购自中国药品生物制品检定所；拉西地平片，规格：每片4 mg,批号：202211008,哈药集团三精明水药业有限公司生产。

仪器LC-20AD液相色谱仪，日本岛津公司产品；Q-Trap 6500+三重四级杆串联质谱仪、Analyst 1.6.3数据采集软件，均为美国AB Sciex公司产品。

2测定条件、溶液配制与血浆样品处理

色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C8(2.1 mm×50.0 mm , 1.7μm);流动相：5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(A)-乙腈(B);流速：0.7 mL·min-1;柱温：40℃;进样体积：20μL。梯度洗脱程序(v∶v): 0～0.8 min, 50% B→85% B;0.8 min～1.5 min, 85% B;1.5 min～1.6 min, 85% B→50% B;1.6～2.5 min, 50% B。

质谱条件电喷雾正离子模式；多反应监测；离子化电压：5 500 V;气帘气：241 kPa;喷雾气：379 kPa;辅助加热气：379 kPa;气体加热温度：550℃;拉西地平用于定量的离子对为m/z473.4→354.3,碰撞能为22 V;尼莫地平用于定量的离子对为m/z419.3→343.3,碰撞能为16 V。

储备液配制称取2份拉西地平和1份尼莫地平对照品于棕色EP管，完全溶解于适当体积的甲醇中，制得质量浓度均为1.00 mg·mL-1的拉西地平标准曲线与质控储备液，以及尼莫地平储备液。于-20℃条件下棕色EP管中储存。

工作溶液配制取拉西地平标准曲线储备液，用甲醇-水(1∶1,v/v)稀释，制备质量浓度分别为2.00、6.00、20.0、60.0、200、500、900、1 000 ng·mL-1的标准曲线工作溶液。取拉西地平的质控储备液，用甲醇-水(1∶1,v/v)稀释，制备质量浓度分别为2.00、5.00、120、300、700 ng·mL-1的质控工作溶液(120 ng·mL-1和300 ng·mL-1都是中浓度质控工作溶液)。于2～8℃条件下棕色EP管中储存。

内标工作溶液配制取尼莫地平的储备液，用甲醇-水(1∶1,v/v)稀释成质量浓度为20.00 ng·mL-1的内标工作溶液，于2～8℃条件下棕色EP管中储存。

标准曲线血浆样品和质控血浆样品配制取空白血浆190μL至1.5 mL棕色EP管中，加入不同质量浓度的拉西地平标准曲线工作溶液或质控工作溶液10μL,涡旋混合均匀，制备质量浓度为0.10、0.30、1.00、3.00、10.00、25.00、45.00、50.00 ng·mL-1的标准曲线血浆样品，或质量浓度为0.10、0.25、6.00、15.00、35.00 ng·mL-1的质控血浆样品。

血浆样品处理吸取待测血浆样品50μL至1.5 mL棕色EP管中，加入内标工作溶液(20 ng·mL-1)20μL,涡旋30 s,加入乙腈200μL,涡旋30 s, 4℃下以13 000×g离心10 min,室温下转移上清液100μL至棕色进样小瓶中，进样分析。

3方法学考察

专属性分别制备6个不同来源的比格犬空白血浆样品和口服给药后的血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，进样分析，与随行标准曲线的定量下限(lower limit of quantification, LLOQ)样品进行比较，观察待测物以及内标峰是否与内源性物质色谱峰分离完全，确保基质中没有干扰物影响待测物定量。

残留效应制备1份定量上限血浆样品和6份空白血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，两者交替进样考察残留情况。

标准曲线与LLOQ吸取标准曲线血浆样品50μL,按“血浆样品处理”项下操作，每个浓度水平2个重复，制备两套标准曲线血浆样品，分别在1个分析批次的开始和结尾处进样。采用加权(权重因子1/x2)最小二乘法，以待测物血药浓度为横坐标x,待测物与内标峰面积的比值为纵坐标y,对2条标曲进行回归运算，求得线性回归方程，并确定LLOQ。

精密度与回收率取质量浓度分别为0.10、0.25、6.00、15.00、35.00 ng·mL-1的质控血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，每个浓度水平6个重复，连续测定3 d,与当日标准曲线样品一同进样测定浓度，计算批内、批间精密度和准确度。取质量浓度分别为0.25、6.00、15.00、35.00 ng·mL-1的质控血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，每个浓度水平6个重复，进样分析后所得峰面积记为A;取空白血浆50μL,加乙腈200μL沉淀，离心后取上清液，用上清液配制所需浓度的对照品溶液，每个浓度水平6个重复，进样分析后所得峰面积记为B。以A/B×100%来计算拉西地平提取回收率。

基质效应通过制备低、中、高浓度的质控样品，考察基质效应。取空白血浆50μL,加乙腈200μL沉淀，离心后取上清液，用上清液配制所需浓度的对照品溶液，每个浓度水平6个重复，进样分析后所得峰面积记为C;取乙腈—水(1∶4,v/v)配制相同浓度的纯溶液样品，每个浓度水平3个重复，进样分析后所得峰面积记为D。以C/D来计算基质因子。

稳定性考察储备液和工作溶液在室温下避光放置4 h的短期稳定性和在-20℃冰箱中储存20 d的长期稳定性。制备低、高浓度的全血质控样品，考察室温条件下避光放置4 h的全血稳定性。制备低、高浓度的质控血浆样品，考察室温条件下避光放置4 h的短期稳定性、3次完整冻融循环(-80℃至室温)、-80℃冰箱中放置20 d的长期稳定性、样品处理后在自动进样器中(4℃)放置24 h的稳定性。

4药代动力学研究

6只比格犬口服拉西地平片4 mg。

于前肢小隐静脉埋置留针，服药前取空白血，服药后于20、40 min和1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h分别采血3 mL于涂有肝素的试管中，立即以1 700×g离心10 min,分离上层血浆，于-80℃冰箱中保存备用。

5统计学处理

用Drug and Statistics(DAS)3.0软件通过非房室模型计算有关药代动力学参数。

2、结果

1方法学评价

专属性拉西地平和尼莫地平的保留时间分别为1.18和0.88 min(图1),结果表明，拉西地平与干扰峰完全分离，生物样品中的内源性物质对拉西地平和内标的检测没有影响。

图1拉西地平(1)和尼莫地平(2)典型色谱图

残留效应空白血浆样品中拉西地平保留时间处残留色谱峰的峰面积不超过LLOQ的20%,残留并不影响拉西地平的准确测定。

标准曲线与LLOQ比格犬血浆中拉西地平的线性范围为0.100～50.0 ng·mL-1,典型的标准曲线回归方程为y=0.021x+0.001,r=0.996 6。本分析方法在考察浓度范围内线性关系良好，LLOQ为0.100 ng·mL-1。

精密度与回收率拉西地平的批内、批间相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)均小于12%,相对误差(relative error, RE)均在±10%以内；在低、中、高浓度血浆质控样品中，提取回收率在80.94%～89.14%,提取效率高且稳定，结果见表1。

基质效应拉西地平4个质控浓度的基质因子分别为0.22、0.21、0.24、0.20,其RSD分别为7.05%、5.11%、6.44%、10.83%,总体RSD为9.28%。说明本方法中拉西地平存在一定的基质效应，但在不同浓度的血浆样品中，基质效应十分稳定，因此并不影响拉西地平的准确定量。

稳定性在溶液稳定性考察中，不同保存条件下的样品RE均在±10%以内，且同浓度样品RSD均小于10%,表明溶液在室温下避光放置4 h和在-20℃冰箱中储存20 d的稳定性良好。全血稳定性考察中，低、高浓度的全血质控样品RE分别为-11.35%、11.37%,同浓度样品的RSD均小于11%,表明全血样品在室温下避光放置4 h的稳定性良好。血浆样品的短期稳定性、冻融循环稳定性、长期稳定性和样品处理后稳定性结果均良好。

表1用UHPLC-MS/MS法测定比格犬血浆中拉西地平的精密度和回收率

2方法学应用

本方法成功应用于拉西地平在比格犬体内的药代动力学分析，其平均血药浓度-时间分布曲线见图2,药代动力学参数见表2。

图2比格犬口服拉西地平片平均血药浓度-时间曲线

表2比格犬口服拉西地平片剂的药代动力学参数

3、讨论

以往有关拉西地平的血药浓度测定和药代动力学研究的报道中，样品前处理都是液液萃取法[4-5],需要进行氮气吹干并复溶，有时还需要加入氨水进行碱化[6-8],耗时费力。本文用蛋白沉淀法对血浆样品进行处理，该方法简单快速。

在对基质效应进行考察时，发现本方法中拉西地平存在一定的基质效应，用改变色谱条件和沉淀比例的方法进行改善，发现拉西地平的保留时间延长至4.52 min,当沉淀比例为1∶10(血浆样品：乙腈，v/v)时，基质效应基本消除，但这时LLOQ约为1 ng·mL-1。虽然该方法存在一定的基质效应，但精密度和准确度结果良好，基质效应并不影响拉西地平在血浆中的准确定量；且不同浓度血浆样品总体的基质因子的RSD不超过15%,满足中国药典2020版[9]对生物样品定量分析的要求。

参考文献:

[1]朱焰,王敏伟.钙拮抗剂药理研究进展[J].医学研究通讯,2000,29(2):40—41.

[3]李乐.新型钙拮抗剂拉西地平的药理与临床应用[J].中国新药杂志,1997,6(3):24—28.

[4]吴春暖,孙进,何仲贵,等.拉西地平固体分散体在Beagle犬体内的药动学和生物等效性研究[J].现代药物与临床,2018,33(12):3096—3101.

[7]钟小斌,林自中,黎渊弘,等.UPLC/MS/MS法研究拉西地平片的人体药动学[J].广西医科大学学报,2009,26(2):269—271.

[8]苏甦,王之舟,沈芊,等.HPLC-MS/MS法测定人血浆中拉西地平药物浓度的方法学研究[J].中国药师,2017,20(7):1196—1200.

[9] Ch.P(2020) VolⅡ,中国药典2020版[S].二部.2020:52—54.

基金资助:沈阳药科大学中青年教师事业发展支持计划基金资助项目(ZQN202305);

文章来源:王燕燕,姜宜宏,赵小英,等.用UHPLC-MS/MS法测定比格犬血浆中拉西地平的浓度[J].中国临床药理学杂志,2024,40(20):3038-3041.