高血压是严重威胁我国人民健康的重大公共卫生问题，目前我国患心血管疾病的人数达3.3亿，其中高血压患者最多达2.45亿[1,2]。高血压的发病机制目前仍未完全阐明，较为公认的有血管内皮功能障碍、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、交感神经系统的激活、G蛋白偶联受体信号受到干扰等，各种复杂的病理生理机制有一个共同点就是活性氧的利用度增加，即氧化应激 (oxidative stress, OS),活性氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 的生成和抗氧化防御之间的不平衡而导致疾病[3,4]。

空气负离子(negative air ions, NAIs) 指大气中带负电荷的单个离子或离子簇，是大气中重要的组成成分，对于维持大气圈的电荷平衡具有非常重要的意义[5]。NAIs具有多种潜在的生物学效应，如降低血压，调节呼吸系统功能、睡眠和情绪，抑制细菌增长等[6,7]。研究发现NAIs对暴露于颗粒物的人永生化角质形成细胞具有抗炎和抗氧化作用，可用于防治与颗粒物相关的炎症性皮肤病[8]。NAIs还可通过抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和血管生成的作用，改善脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤，促进糖尿病创面愈合[9]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 途径是生物体中的主要信号通路之一，具有调节炎症反应和细胞因子的作用。MAPKs包括3种类型信号通路，其中细胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinase, ERK) 信号通路参与调节细胞生长和分化，c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinas, JNK)和p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen- activated protein kinase, p38 MAPK) 通路在炎症和凋亡中起着重要作用[10]。氧化应激可激活MAPKs和转录因子激活蛋白1 (transcription factor activator protein 1, AP-1),NAIs则可通过抑制ROS/p38 MAPK/AP-1途径，降低AP-1途径调节的促炎细胞因子的表达水平[8,11],因此推测NAIs可通过抗炎和抗氧化作用平衡高血压患者体内的OS水平，进而引起血压下降。为初步验证该假设，本研究拟选择原发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat, SHR) 和正常血压成年大鼠 (Wistar-Kyoto, WKY) 开展动物实验，通过给予NAIs干预，明确NAIs对SHR大鼠血压、氧化应激及炎症状态的影响及可能的机制。

1、材料与方法

1.1 仪器和试剂

负离子发生器(A8左杉科技),KEC-990负离子测试仪(KEC-990,日本KEC公司),动物无创血压检测系统(BP-2000分析系统，美国Visitech Systems公司),电子分析天平(德国Sartorius公司),轮式全自动切片机(德国Leica公司),组织包埋机及冰冻切片机(美国Thermo公司),摊片机(美国Sigma公司),高通量组织匀浆机(德国QIAGEN公司),酶标仪(DNM-9602G,北京普朗公司),Biotech多功能酶标仪(H1MD,美国BioTEK公司),高分辨全景成像系统(德国Leica公司)。

HE染色试剂盒、PI磷酸酶抑制剂(MCE)RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂及BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；全血ROS检测试剂盒，上海贝博生物科技有限公司；ELISA试剂盒、丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 测试盒(A003-1)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 测试盒(A001-3)和谷胱甘肽测试盒(A061-1),南京建成；兔抗大鼠p38 MAPK一抗、兔抗大鼠ERK一抗、鼠抗大鼠JNK一抗、鼠抗大鼠JUN一抗、鼠抗大鼠FOS一抗、鼠抗大鼠β-actin一抗、HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗和HRP Goat Anti- Rabbit IgG(H+L)二抗，Proteintech公司；兔抗大鼠p-p38 MAPL一抗、兔抗大鼠p-JNK一抗和兔抗大鼠p-FOS一抗，Affinity公司；兔抗大鼠p-JUN一抗，成都正能生物技术有限公司；兔抗大鼠p-ERK一抗，美国CST公司；全自动化学发光成像分析系统(Tanon 5200,上海天能科技有限公司)。

1.2 实验动物分组及处理

选择无特定病原体级(specific pathogen free, SPF)SHR 60只 (雌雄各半),体重160～210 g, 根据干预时间随机分为1个月和3个月两组，每组30只，每组再根据每日干预时间随机分为SHR对照组、2 h NAIs-SHR组和6 h NAIs-SHR组，每组10只。另取SPF级WKY 20只，体重160～210 g, 根据干预时间随机分为1个月WKY组和3个月WKY组，每组10只。以上大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可编号：SCXK(京)2016-006],均通过中国医科大学实验动物伦理委员会批准(IACUC编号：CMU2021219)。实验大鼠笼养，每笼5只，饲养温度22～26 ℃,湿度50%～60%,光照12 h/d, 所有大鼠自由饮水、进食，垫料隔日更换一次，每周称量一次体重。

NAIs干预组：将负离子发生器置于长×宽×高为3 m×3 m×3 m的试验空间，检测NAIs浓度达到4.5×104～5×104个/cm3(相当于森林空气中NAIs浓度的10倍),同时检测PM2.5和PM10浓度。将大鼠置于试验空间中，2 h NAIs-SHR组和6 h NAIs-SHR组每天分别干预2 h和6 h, 1个月组连续干预1个月，3个月组连续干预3个月。对照组：SHR对照组和WKY组均给予正常空气(NAIs浓度为400～500个/cm3)。在干预组干预期间检测NAIs、PM2.5和PM10浓度。

1.3 样品采集、保存及脏器测量

各组大鼠干预结束后，采取乙醚麻醉，颈脱臼法处死，腹主动脉采血，迅速剥离胸主动脉，转移至-80 ℃冰箱；血清分离管室温静置1 h后，3000 r/min离心10 min, 取上清保存-20 ℃冰箱。采用电子分析天平称取各脏器重(湿重)并记录，计算脏器系数(脏器湿重/体重)。

1.4 血压监测

使用动物无创血压计，于早上8—10点间测量各组大鼠的血压，测压前2 h禁食禁水，每只大鼠每次测10组数据取平均值，每周测3次取平均值代表一周血压平均水平，连续监测1个月或3个月。

1.5 氧化应激水平和炎性因子水平的检测

根据试剂盒说明，采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 法检测大鼠血清8-羟脱氧鸟苷 (8-hydroxylated deoxyguanosine, 8-OHdG)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-8 (interleukin-8,IL-8) 和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 水平；全血ROS检测试剂盒测定ROS水平；比色法检测MDA、SOD、还原型谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 和氧化型谷胱甘肽 (glutathione disulfide, GSSG) 水平。

1.6 血管内皮功能检测

1.6.1 大鼠胸主动脉组织病理形态检测

将大鼠胸主动脉固定在4%多聚甲醛中过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡后将组织块放入模具中进行包埋。将制好的石蜡组织块放入组织切片机中，切片厚度设为5 μm, 爬片后60 ℃烤箱2 h, 4 ℃保存。再经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，常规HE染色后光镜下观察大鼠胸主动脉组织病理形态。

1.6.2 血清NO、ET-1水平检测

根据试剂盒说明，采用ELISA法检测大鼠血清一氧化氮(nitric oxide, NO) 和内皮素-1 (endothelin-1, ET-1) 水平。

1.6.3 大鼠胸主动脉MAPK/AP1信号通路检测

Western blotting法检测各组大鼠胸主动脉ERK、JNK、p38、c-fos、c-jun蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平。取0.03 g组织，PBS冲洗，加入300 μL蛋白裂解液(裂解液∶PMSF=100∶1)。破碎器破碎组织，冰上静置裂解30 min后，12 000 r/min, 4 ℃离心20 min, 取上清液，即为提取的组织蛋白。经BCA 法进行蛋白浓度定量后制备蛋白样品，配置分离胶与浓缩胶，加样电泳，电泳结束后转至硝酸纤维素膜上，在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温封闭2 h, 封闭后TBST洗膜，条带置于一抗中，4 ℃过夜。用BSA稀释抗体，室温孵育1 h。TBST洗膜，使用全自动化学发光成像分析系统分析。计算各组目的蛋白与内参β肌动蛋白(β-actin) 比值或各组磷酸化蛋白与总蛋白比值作为其相对水平。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料符合正态或近似正态分布，用均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较使用单因素方差分析(one way-ANOVA),两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 大鼠体重及脏器系数变化

随着动物周龄的增长，各组大鼠体重均有增加。同周龄WKY雄鼠体重明显高于SHR雄鼠 (P<0.05)。

由表1可见，心脏脏器系数SHR对照组较WKY组高 (P<0.05)。

表1 大鼠脏器系数

2.2 大鼠尾动脉收缩压变化

各组大鼠基线收缩压分别为：WKY组135.3±8.5 mmHg, SHR对照组(165.3±8.8)mmHg, 2 h NAIs-SHR组(167.0±8.8)mmHg, 6 h NAIs-SHR组(164.6±9.5)mmHg, 同周龄WKY组均较SHR对照组、2 h NAIs-SHR组和6 h NAIs-SHR组血压低 (P<0.05)。

由图1可见，随着大鼠周龄增加，SHR对照组大鼠收缩压也随之上升。NAIs干预期间，第2～5、8～11周2 h NAIs-SHR组和6 h NAIs-SHR组血压均显著低于SHR对照组，第12、13周6 h NAIs-SHR组收缩压较SHR对照组低，第13周6 h NAIs-SHR组收缩压较2 h NAIs-SHR组低，以上差异均具有统计学意义 (P<0.05)。

图1 各组大鼠尾动脉收缩压变化(n=10)   

2.3 大鼠胸主动脉组织病理变化

由图2和图3可见，WKY组胸主动脉内膜结构正常，内皮完整，表面光滑，中膜平滑肌细胞排列整齐，外膜与中膜分界明显。SHR对照组动脉内膜结构紊乱，内皮不完整，有凸起及缺损，中膜增厚，外膜破裂且有大量沉积物。2 h NAIs-SHR组和6 h NAIs-SHR组胸主动脉内膜结构均较SHR对照组有不同程度的改善，内膜较光滑，中膜增厚减少，外膜与中膜分界较清楚(如图中箭头所示)。

2.4 大鼠血清氧化还原水平

由表2可见，与WKY组相比，3个月SHR对照组血清GSH/GSSG下降 (P<0.05);与SHR对照组相比，6 h NAIs-SHR组ROS、8-OHdG均较低(P<0.05),1个月6 h NAIs-SHR组GSH/GSSG较高 (P<0.05);与2 h NAIs-SHR相比，6 h NAIs-SHR组ROS均较低 (P<0.05)。

2.5 大鼠血清炎性因子水平

由表3 可见，与WKY组相比，SHR对照组血清TNF-α水平均较高 (P<0.05)。与SHR对照组相比，6 h NAIs-SHR组血清IL-8水平降低 (P<0.05)。

2.6 大鼠血清内皮因子-1和一氧化氮水平

由表4可见，与WKY组相比，1个月SHR对照组血清ET-1水平较低 (P<0.05)。

2.7 大鼠胸主动脉MAPK/AP-1信号通路相关蛋白表达水平

由图4、图5可见，与WKY组相比，1个月SHR对照组胸主动脉的p-p38蛋白相对表达量较低 (P<0.05)。

由图6、图7可见，与WKY组相比，3个月SHR对照组胸主动脉p-p38蛋白相对表达量较高(P<0.05),SHR对照组p-c-fos蛋白相对表达量较低 (P<0.05);与SHR对照组相比，3个月2 h NAIs-SHR组和6 h NAIs-SHR组胸主动脉的p-p38和p-c-fos蛋白相对表达量均较低 (P<0.05)。

图2 1个月各组大鼠胸主动脉组织病理变化 (HE染色；100 μm, ×20;50 μm, ×40)

图3 3个月各组大鼠胸主动脉组织病理变化 (HE染色；100 μm, ×20;50 μm, ×40)   

表2 大鼠血清氧化还原水平

表3 大鼠血清炎性因子水平

表4 大鼠内皮因子-1和一氧化氮水平

图4 1个月干预各组大鼠胸主动脉MAPK 信号通路相关蛋白表达水平(n=4)   

图5 1个月干预各组大鼠胸主动脉AP1 信号通路相关蛋白表达水平(n=4)   

图6 3个月干预组大鼠胸主动脉MAPK信号 通路相关蛋白表达水平(n=4)  

图7 3个月干预组大鼠胸主动脉AP1信号 通路相关蛋白表达水平(n=4)   

3、讨论

氧化应激是高血压发病的病理生理机制之一[3,4],研究表明NAIs可通过抗炎和抗氧化作用，预防颗粒物相关的炎症性皮肤病、促进糖尿病创面愈合和改善呼吸系统症状[8,9,12,13]。本研究发现给予SHR大鼠高浓度NAIs 1个月或3个月后，NAIs干预组大鼠的胸主动脉内、中和外膜均较有不同程度的改善，氧化应激及炎症水平的部分指标得到缓解，血压下降明显，但对SHR大鼠脏器系数和体重影响较小。这与SUZUKI 等[14]发现5000～8000个/cm3浓度NAIs给予成年雄性Wistar大鼠后可显著降低其血压的研究结论相一致。

ROS起着调控血管内皮功能的作用，可参与血管内皮炎症、增殖、迁移、凋亡、血管生成等过程[15,16,17]。SOD、MDA、GSH/GSSG和8-OHdG均是氧化应激的主要生物标志物[18],研究表明当机体产生大量ROS时，其代谢产物MDA随着年龄的增加而增加，而SOD活性则明显下降，进而导致血管平滑肌细胞反应性下降，促进原发性高血压的发展[19]。本研究给予高浓度NAIs后发现，SHR大鼠血清ROS和8-OHdG水平下降，GSH/GSSG比值升高，且每天NAIs干预时间越长，其氧化炎症水平改善越明显。但是对血管内皮舒张因子NO和收缩因子ET-1影响不显著。由此推断，NAIs干预可部分改善SHR大鼠血清氧化还原水平，从而改善氧化应激状态，使得其血压有所下降。

氧化应激可激活JNK、p38 MAPK途径和NF-κB转录因子来促进炎症过程，使得重要炎性细胞因子如IL-6、IL-8和TNF-α 等表达增加，进一步促进炎症反应[20,21,22,23,24]。本研究发现NAIs干预后SHR大鼠血清中IL-8水平下降，胸主动脉p38磷酸化蛋白相对表达量也下调，且整体干预时间越长，其下降越显著。与周玉珠[25]发现治疗高血压脑出血，可明显降低血清IL-8水平的结论相一致。提示在4.5×104～5×104个/cm3 NAIs浓度干预下，可能通过抑制p38 MAPK信号通路，改善高血压大鼠血清中IL-8炎症水平。

AP1是一类与特定DNA序列结合的二聚体转录因子家族，由Jun家族成员彼此间形成同源或异源二聚体组成，Jun蛋白也可与Fos家族成员形成异二聚体，[26]。c-Fos和c-Jun属于快速反应基因 (immediate early genes, IEGs) 家族成员，其中c-fos基因是p38 MAPK通路中下游转录因子[27]。本研究发现NAIs干预SHR后，胸主动脉的p38和c-fos的磷酸化蛋白相对表达量呈显著下降，提示NAIs可能通过p38信号通路调控AP1水平，进而改善SHR血压。然而c-fos具体是通过调控哪些关键基因的表达，以改善血压的具体机制，有待进一步探索。

综上，本研究采用4.5×104～5×104个/cm3浓度NAIs干预SHR 1个月和3个月，发现NAIs可部分改善SHR大鼠氧化和炎症水平，而出现这一现象的可能机制是通过MAPK/AP1信号通路来调节的，可为大气NAIs的降压作用提供了理论基础。

参考文献:

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[25]周玉珠.通腑化浊开窍方联合西医常规治疗高血压脑出血急性期42例临床观察[J].甘肃中医药大学学报,2019,36(4):43-47.

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基金资助:国家自然科学基金(No.82060603);海南省自然科学基金高层次人才项目(No.820RC648);

文章来源:李娜,魏天静,肖明扬等.空气负离子对原发性高血压大鼠血压､氧化应激和炎症水平的影响及机制[J].卫生研究,2024,53(02):300-309.