布南色林是具有全新化学结构的高度选择性多巴胺D2及5-HT2A受体拮抗剂,由日本住友制药株式会社研发并于2008年在日本上市[1]。该药物于2017年获原国家食品药品监督管理总局批准并在中国上市销售。BNS能明显改善精神分裂症的阳性症状(如幻觉、错觉等)和阴性症状(如情绪消沉、运动功能减退等),减少锥体外系不良反应发生率(帕金森综合征、急性肌张力障碍、静坐不能等)及其他不良反应,其安全性和耐受性明显优于传统抗精神病药物[2,3]。

BNS的水溶性很差,但在乙醇等有机溶剂中呈现较高的溶解度,属于BCSⅡ类化合物[4,5]。临床数据显示,上市的BNS片剂(规格为4mg)的口服绝对生物利用度为55%。比较餐后给药与空腹给药的药代动力学数据,显示餐后cmax和AUC0-12分别比餐前提高了2.68倍和2.69倍[6]。也有临床数据显示,饮酒可提高BNS的口服生物利用度[7]。以上信息都显示,BNS的口服生物利用度可能还有进一步提高的空间。目前国内外已上市BNS制剂仅有普通片剂,有报道将BNS负载在高比表面积的无机材料如高岭土表面,与脂类物质协同促进其口服吸收[8]。

自乳化药物传递系统能提高许多难溶性药物的表观溶解度,且能够促进药物经小肠黏膜吸收,进而提高药物的口服生物利用度[9,10,11]。在自乳化制剂中药物以溶解状态存在于自乳化所形成的小油滴中,因此难溶性药物的溶出过程不再成为其体内吸收的限速步骤。自乳化制剂能增加药物的淋巴转运,减小首过效应,直接或间接的提高药物的生物利用度,同时自乳化制剂在接触到体液后在胃肠道蠕动的作用下自发的将药物包裹于乳滴中,可有效增加难溶性药物的吸收。本文作者首次试图将BNS开发成自乳化制剂,以期提高BNS口服生物利用度。

1、仪器与材料

Waters1525型高效液相色谱仪(配Empower工作站,美国Waters公司),ZetasizerNanoZS90型激光粒度分析仪(英国Malvern公司),JEM-1230型透射电镜(日本NipponElectronics株式会社),EL204万分之一电子天平(瑞士MettlerToledo公司),TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂),XH-T漩涡混合器(金坛区白塔新宝仪器厂),DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

BNS原料药(含量质量分数:99.0%,批号:20170813,武汉大华伟业医药化工有限公司),阿立哌唑(aripiprazole,ARP,内标物,含量质量分数:99%,批号:20180302,中山联久生物科技有限公司),肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯(上海泰坦科技股份有限公司),油酸聚乙二醇-6甘油酯(Labrafil®M1944CS)、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol®)、二乙二醇单乙醚(Transcutol®P)、丙二醇单辛酸酯(Capryol®90)(法国Gattefossé公司),聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor®EL,德国BASF公司),吐温40(Tween40)、吐温80(Tween80)(国药集团化学试剂有限公司),水为去离子纯净水,其他所用试剂均为色谱纯或分析纯。

2、方法与结果

2.1色谱条件与标准曲线的测定

色谱分离柱:DiamonsilC18(150mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-20mmol·L-1NaH2PO4磷酸盐缓冲液(pH3.0)(体积比为90∶10),流速:1.0mL·min-1,紫外检测波长:238nm,柱温:30℃,进样量:20μL。使用该色谱条件测定BNS时,出峰时间为8.3min,且各辅料对BNS出峰无干扰。

精密称取BNS1mg于5mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,配制成质量浓度为200mg·L-1的溶液作为储备液。精密称取适量分别置于10mL量瓶中,用流动相稀释得系列标准溶液,进HPLC测定。以质量浓度(ρ)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,得标准曲线方程Y=5.2768×104ρ-3.9598×104,r=0.9999(n=3),显示BNS质量浓度在2～200mg·L-1内线性关系良好。

2.2溶解度的测定

分别称取油相、表面活性剂或助表面活性剂2.0g于试管中,分别加入过量的BNS原料药,采用摇瓶法测定BNS在各相中的饱和溶解度[12],测定结果见表1。

表1BNS在不同介质中的溶解度(37℃)

2.3油相和表面活性剂的确定

根据溶解度数据,选择BNS溶解度较大的油相和表面活性剂进行处方配伍考察。油相选择Capryol®90和油酸乙酯,表面活性剂选择Labrasol®和Tween80。在37℃水浴中将油相和表面活性剂按质量比1∶1混匀,保温5min后,加入100倍预热至37℃的纯水,于50r·min-1磁力搅拌使其发生自乳化。以成乳后的色泽和乳化时间为指标考察乳化情况。

结果显示,以Labrasol®为表面活性剂时无法形成自乳化微乳,只能选择Tween80作为表面活性剂。以油酸乙酯为油相时,乳化时间在1min以内,且形成的微乳呈现微泛蓝色,而使用Capryol®90作为油相时,体系稍黏稠,且加水形成的微乳略浊,故选择油酸乙酯为油相。

2.4助表面活性剂的确定

以油酸乙酯为油相,Tween80为表面活性剂,通过绘制伪三元相图筛选助表面活性剂Transcutol®P和乙醇。助表面活性剂、表面活性剂和油相按照一定质量比(1∶1∶8、1∶2:7、1∶3∶6、……、8∶1∶1)配制成一系列自乳化制剂,置于试管中,涡旋2min使其混合均匀,从中取约0.1mL的自乳化制剂,加于10mL蒸馏水中,在37℃条件下磁力搅拌。待其自乳化完全后,从形成乳剂的澄明度和颜色来考察确定该处方能否形成微乳剂。用OriginPro8软件绘制伪三元相图(图1),以微乳区面积为指标筛选助乳化剂。

图1自乳化制剂的三元相图

在图1所示的三元相图中,黑点代表能形均一透明、无色或微蓝色的自乳化区域。比较两个相图能形成自乳化区域的面积可知,当油相为油酸乙酯,表面活性剂为Tween80,助表面活性剂为Transcutol®P时,可形成自乳化的区域最大。综合考虑BNS在各相中的溶解度,以及各相混合后可形成自乳化制剂的能力,确定油酸乙酯-Tween80-Transcutol®P作为配伍处方。

2.5星点设计-效应面优化法优选处方

2.5.1星点设计

在三元相图基础上,采用星点设计-效应面优化法优化处方[13,14]。以油相含量质量分数(X1,woil/%)和表面活性剂/助表面活性剂的比例Km(X2)为自变量,因素水平见表2。根据三相图的结果,限定X1的质量分数取值为10%～40%,X2的取值为0.3～8.0。按照星点设计安排表制备自乳化制剂,以平均粒径(R1,dpartical/nm)、乳化时间(R2,temulsification/s)和载药量[R3,ρdrugloading/(g·L-1)]作为考察指标,以总评OD值为效应变量,采用DesignExpert10.0.7软件进行2因素、5水平的星点设计。按表中比例,精密称取油酸乙酯、Tween80和Transcutol®P,制备自乳化制剂,通过HPLC测定BNS峰面积,计算BNS自微乳的载药量。用激光粒度扫描仪测定乳液粒径,以目测法观察处方是否完全乳化并用秒表记录时间。实验方案及结果见表3。

表2星点设计的因素和水平

2.5.2实验结果及模型拟合

使用总评OD值,即通过采用Hassan方法进行数学转换,将数据“归一化”处理,求出dmin和dmax,dmin=(ymax-yi)/(ymax-ymin),dmax=(yi-ymin)/(ymax-ymin);OD=(d1d2…)1/n,n为指标数。通过各实验结果求得OD值,以总评“OD值”作为效应对实验进行优化,最后得到综合效应最佳的处方组成[15,16]。

表3星点设计的试验和结果

采用DesignExpert10.0.7软件,对粒径、乳化时间、载药量、OD值进行多元线性回归、二项式及三项式模型拟合,通过相关系数(r)和置信度(P)对模型的拟合程度进行判断。在进行多元线性回归拟合时r=0.1990,P=0.8169,拟合度不好,显示方程预测性不好,因此多元线性回归拟合不适用;在进行二项式模型拟合时r=0.4111,P=0.9072,拟合度仍然不好,显示方程预测性不好,因此二项式模型拟合不适用;在进行三项式模型拟合时r=0.9378,P=0.0439<0.05,显示模型具有显著性。

三项式拟合方程:

R1=22.14+66.33A-82.77B-36.33AB+35.74A2+52.47B2+45.39A2B+14.4AB2,r=0.9941,P=0.0002;

R2=72.4+13.08A-6.72B-0.5AB-22.7A2+1.3B2+31.72A2B+7.92AB2,r=0.9712,P=0.0075;

R3=26.9+7.92A-6.75B-1.3AB-0.21A2+2.22B2-4.85A2B-3.62AB2,r=0.9720,P=0.0070;

OD=0.44+0.15A+0.13B+0.071AB-0.073A2-0.084B2-0.31A2B-0.41AB2,r=0.9378,P=0.0439。

2.5.3效应面优化

根据“2.5.2”条三项式模型方程拟合结果,使用Designexpert10.0.7软件做出2个自变量woil/%和Km对OD值的效应面和二维等高线图,从图中可以看出,随着woil/%的增大OD值大体呈现由大变小的趋势,随着Km的变大(即表面活性剂占比增大)OD值大体呈现先增大后变小的趋势,woil/%和Km都对OD值有显著影响(图2)。

图2woil/%和Km作为因变量的二维等高线图和三维效应面图

2.5.4模型结果分析

通过三项式模型方程拟合及限定三个指标的取值范围来预测出最佳的取值区域,即粒径限定在0～100nm之间,乳化时间限定在3～60s之间,载药量不低于25g·L-1。根据预测结果及OD值在效应面图中最大值的位置可以得知,当OD值位于效应面的端点处(OD=0.793)时各项指标最优,即粒径最小、乳化时间最短、载药量最大,但是端点处任一因素的微小变化都会对制剂的质量产生较大的影响,考虑到处方工艺的耐用性,最终确定的处方为:X1=26.3、X2=2.3,符合三项式模型拟合预测的结果,且各项指标的检测结果均能在预先设定的范围内。

2.6处方验证及质量评价

2.6.1载药量

按最终确定的处方,在37℃水浴条件下将油酸乙酯、Tween80和Transcutol®P以质量比为1.00∶1.95∶0.85的比例混合,加入过量的BNS并搅拌均匀,测定该处方条件下的载药量。结果显示,该处方的载药量为35.3g·L-1,是BNS的水溶解度(35mg·L-1)约1000倍,与Designexpert10.0.7软件预测的最优处方载药量(34.9g·L-1)相比较,最终确定处方载药量与预测结果基本一致。

2.6.2外观及粒径

按处方制备BNS自乳化制剂,加入质量分数为1%的BNS并搅拌均匀,即得到BNS自乳化制剂。取上述BNS自乳化制剂适量,在37℃水浴和50r·min-1磁力搅拌条件下,加入100倍量已预热至37℃的纯水,待充分乳化后,再取适量稀释并在透射电镜下观察(图3),同时用激光粒度测定仪测定粒径。结果显示,该处方制得的BNS自乳化制剂可在1min内乳化完全,得到澄清透明泛微蓝色光的微乳液,形成的微乳油滴呈现球形或近球形,平均粒径为44.3nm,Zeta电位为-20.21mV。

图3BNS自乳化制剂的透射电镜图

2.6.3体外溶出度

取等含药量的BNS自乳化制剂与BNS原料药,照《中华人民共和国药典》2015年版(第四部)第二法(浆法),溶出介质分别为900mL的pH6.8的磷酸盐缓冲溶液、0.1mol·L-1盐酸溶液和水,温度为37℃,搅拌速度为50r·min-1,分别于5、10、20、30、45和60min定时取样10mL,同时补充等体积相同温度介质,样品经微孔滤膜过滤(孔径0.45μm)过滤后,取续滤液经适当稀释,进HPLC测定样品浓度并计算溶出度(结果见图4)。结果显示,BNS自乳化制剂在不同溶出介质当中的溶出速度都比BNS原料药的溶出速度快。

图4BNS自乳化制剂和BNS原料在pH6.8的磷酸盐缓冲溶液、0.1mol·L-1HCl、水中的溶出度

2.7药代动力学研究

比较BNS混悬液(以质量分数为0.5%的CMC-Na作为助悬剂)与BNS自乳化制剂的体内药代动力学。将12只雄性SD大鼠随机分为2组,以灌胃的形式分别给予BNS混悬液和BNS自乳化制剂。SD大鼠实验前禁食12h,自由饮水。口服BNS剂量均为20mg·kg-1,于给药前和给药后15、30、60、90、120、180、240、360min,眼眶静脉丛采血0.3mL,置于肝素化EP管中,12000r·min-1,离心4min。取上清血浆,存储在-20℃冰箱待测。临测定前,取血浆100μL于EP管中,加入ARP的甲醇溶液(质量浓度50mg·L-1)50μL,涡旋1min后,加入0.1mol·L-1NaOH水溶液0.1mL,涡旋10s后加入乙酸乙酯1.0mL,涡旋1min,10000r·min-1离心5min,吸取有机相0.5mL置于另一EP管中,氮气吹干,加入流动相100μL,使残余物复溶,12000r·min-1离心5min,吸取上清液,并通过液质联用测定BNS和ARP的浓度,并计算BNS在血液样品中的实际浓度。

液质联用条件:UPLC-MS/MS液质联用仪(液相部分为WatersAcuityUPLC,质谱部分为WatersXevoTQ三重四级杆质谱)。

2.7.1色谱条件

色谱柱:WatersXBridgeBEHC18(50mm×2.1mm,2.5μm)、WatersXBridgeBEHC18前置保护柱(5mm×2.1mm,2.5μm),流动相:甲酸铵缓冲液(5mmol·L-1,pH4.5)-乙腈(体积比为15∶85),流速:0.3mL·min-1,柱温:35℃,进样量:3μL。

2.7.2质谱条件

电喷雾离子源,MRM正离子检测模式,BNS离子对368.2→297.2;ARP离子对449.0→285.1;毛细管电压:2.5kV,锥孔电压:27V,碰撞能量:10eV。

从SD大鼠口服给药的药代动力学参数可以看出,BNS自乳化制剂的达峰时间相对于BNS原料药混悬液的达峰时间提前了近一半,同时BNS自乳化制剂的达峰浓度是BNS原料药混悬液的达峰浓度的9.16倍,口服BNS自乳化制剂相对于口服BNS原料药混悬液的生物利用度F为829%,即BNS制备成SEDDS的口服生物利用度相对于BNS原料药制备成混悬液的口服生物利用度提高了7.29倍,显示BNS自乳化制剂较BNS原料药混悬液在SD大鼠体内的吸收速度和程度均有显著提高(表4、图5)。

表4药代动力学参数(n=6)

图5BNS自乳化制剂和BNS原料药的药时曲线

3、讨论

由油相、表面活性剂和助表面活性剂构成的载药自乳化制剂具备较低的油水界面张力,因此遇体液后在胃肠道蠕动所提供的微弱动能的促使下即可发生乳化,形成纳米级的水包油型乳剂。难溶性药物溶解在微小的乳滴中,经胃迅速排空后广泛分布在肠道中,由于其具有较大的比表面积和易于通过小肠壁水化层的特点,使得药物更容易和小肠上皮细胞直接接触,促进了药物的吸收。在自乳化制剂发生乳化的过程中,迅速形成大量的具备纳米级微小粒径的乳滴是关键,它不仅决定了自乳化体系的稳定性,也决定了自乳化制剂的吸收效果。本文作者采用星点设计-效应面优化设计方法,以粒径、乳化时间和载药量为评价指标,以多指标总评“归一值”(即OD值)为效应变量,采用三项式方程对实验数据进行模拟,优选了最佳的辅料比,为后期BNS自乳化制剂成型和体内药代动力学研究提供了一定指导意义。

本文作者采用油酸乙酯-Tween80-Transcutol®P体系,可形成高乳化效率的BNS自乳化制剂,最优处方的载药量可达35.3g·L-1,因此BNS在自乳化制剂中的溶解度远大于在0.1mol·L-1HCl(12.46g·L-1)和pH6.8PBS(3mg·L-1)中的溶解度,由此推断BNS自乳化制剂进入胃部后部分药物溶解分布到胃液中,当胃排空后药物随体液进入肠道中,随着体液pH值的升高,药物又再次溶解到自乳化制剂当中,随自乳化制剂一同被吸收,进而提高药物的生物利用度。动物实验数据也进一步证实了,本研究中,作者制备的自乳化制剂受胃液的影响较小,能够有效地提高BNS在体内的生物利用度。

4、结论

本文作者以Tween80为乳化剂、Transcutol®P为助乳化剂、油酸乙酯为油相成功将BNS制备成自乳化制剂,经星点设计优化后得到了最优处方:油酸乙酯-Tween80-Transcutol®P(质量比为1.00∶1.95∶0.85,),最终确定处方的平均粒径为44.3nm,乳化时间在1min之内,载药量为35.3g·L-1,Zeta电位为-20.21mV,各项检测结果均在预先设定的范围内。BNS自乳化制剂在各个介质中的体外溶出行为明显优于BNS原料药混悬液,体外溶出的结果显示,BNS自乳化制剂显著提高了BNS的溶解度和溶出速率。大鼠体内的药动学研究结果显示,BNS自乳化制剂显著提高了BNS的吸收速度和程度,对BNS生物利用度的改善非常明显。

崔健,刘红兵,张宇.布南色林自乳化制剂的研究[J].沈阳药科大学学报,2020,37(07):577-584+610.