在过去的几十年中,基于纳米颗粒的药物递送系统在疾病的诊断和治疗方面发挥着越来越重要的作用。然而,大数据显示约95%的纳米制剂会被机体免疫系统清除,无法到达预期部位[1]。2016年发表在NatureReviewsMaterials杂志上的一篇文章指出,进入肿瘤的纳米制剂剂量的中位数仅为注射剂量的0.7%[1]。纳米粒子由于“非己”(non-self)特性而被机体识别为非己物质,引起免疫反应和毒性作用。如何规避免疫系统的清除、提高制剂的靶向性,一直是研究的热点与难点。

研究者们从自然界生物系统中得到灵感,猜想源自生物本身的载体应该可以有效躲过机体的识别,于是开始将目光聚集于生物膜仿生型药物递送系统上[2]。红细胞是血液中最丰富,寿命最长(120d)的循环细胞,具有良好的生物相容性、生物可降解性和长循环性,并且不含细胞核与细胞器,结构组成简单,在细胞膜的提取方面比其他血细胞操作更为简便,于是被最先研究用作药物递送系统载体[3]。但是,由于红细胞膜在载药过程中必然会受损,多种受损信号引发的体内不良反应,使得这一体系的临床转化面临巨大挑战。在本文中作者回顾了RBCM药物递送系统的发展历程,对基于红细胞的载药策略进行了总结概述,并重点关注了RBCM纳米药物递送系统存在的潜在问题,希望通过此综述为药剂研究者进一步研究RBCM纳米药物递送系统提供参考。

1、RBCM药物递送系统的发展历程

1658年,荷兰博物学家JanSwammerdam(1637-1680)首次在显微镜下观察到了红细胞[4,5]。1695年,另一位荷兰显微镜学家AntonivanLeeuwenhoek(1632-1723)首次向世人展示了“红色小体”的大小和形状[5,6]。1953年,Gardos用RBCM运载腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP),这一尝试为随后用RBCM运载各种代谢活性物质奠定了基础,开辟了药物递送领域的新天地。1959年,Marsden和Ostling通过低渗溶血的方法成功在红细胞中包载葡聚糖[7]。1994年,Lejeune等[8]采用物理挤压的方式,使RBCM通过具有确定孔径的膜制得RBCM衍生脂质体,并称其为“纳米红细胞体”(nanoerythrosomes),其中装载道诺霉素(Daunorubicin),应用于恶性肿瘤的治疗。这也是首次将RBCM应用于肿瘤治疗领域。经过多年发展,各种治疗急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、胰腺癌和非霍奇金淋巴瘤等疾病的酶、抗原等分子均被用于RBCM纳米药物递送系统候选产品开发。但Désilets等人的研究发现,简单地将活性分子结合到RBCM表面上,除了引起囊泡聚集的趋势之外,还会导致其从血流中快速清除,说明这些缺乏结构完整性的RBCM具有高度不稳定性[9]。2013年,Zhang[10]的研究小组报道了纳米海绵(nanosponge),一种由聚合物纳米颗粒核心与RBCM包裹组成的解毒剂,其可以吸收破坏膜的毒素,将细胞内的毒素转移出去,达到解毒治疗的目的。将成孔毒素嵌入RBCM上,能诱导机体产生大量免疫球蛋白G抗体,可与毒素特异性结合,起到抗毒疫苗的作用[10]。2014年,TheInstituteforCommercializationofPublicResearch报道了RxMP公司在红细胞衍生微颗粒的新型止血剂方面的研究[11],该技术旨在阻止或防止过度出血,减少对输血的需求。此外,RBCM载体在光动力治疗[12]、磁共振成像[13,14]等多个领域也得到研究。基于上述内容,作者绘制了RBCM载体研究的发展图(见图1)。

图1RBCM载体应用发展示意图

2、RBCM载体特性

RBCM作为药物载体具有以下优势:①良好的生物相容性;②生物可降解性;③低免疫原性;④提高药物在体内的稳定性;⑤延长药物半衰期;⑥增加药物靶向性。需要引起注意的是,RBCM载药优势的体现与其相关免疫分子结构的完整性息息相关。

带3(Band3)蛋白是RBCM上一种重要的膜蛋白成分,约占RBCM总蛋白的四分之一,是骨架网络在膜上的主要附着点,影响膜的结构和功能。在红细胞程序性死亡过程的研究中发现,Band3蛋白的聚集是介导受损红细胞被吞噬系统识别和清除的一个重要结合位点[15],因而Band3蛋白结构的破坏会介导RBCM载体在体内的识别清除,不能发挥长循环作用。唾液酸(sialicacid,SA)是细胞膜的重要成分之一,主要修饰于细胞膜表面糖脂、聚糖、糖蛋白或分泌蛋白的末端,是细胞负电荷的主要来源,并且SA在生物信息传递中发挥重要作用,与抗原识别、细胞粘附和信号传导等密切相关。失去唾液酸的红细胞会被巨噬细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinrecipient)识别而引发吞噬作用[16];CD47是RBCM表面的跨膜蛋白,具有调节免疫的作用,可以与SIRPα形成信号复合物,产生抑制性调节信号,被称为“不吃我”(“donoteatme”)信号,使红细胞在体内维持长循环[17,18,19,20]。此外,有研究表明,CD47蛋白构象在自然衰老或氧化受损后会发生变化,这种构象变化会将“不吃我”的信号转换为“吃我”(“eatme”)的信号,促进红细胞的清除[21]。因此,维持CD47蛋白结构的完整性是RBCM载体发挥长循环作用的重要保障。

很显然,保持RBCM表面分子结构完整是展现RBCM载药优势的前提。否则,“伤痕累累”的RBCM不仅不能发挥其载体作用,反而会加剧药物的清除,造成生物相容性受损、药物泄漏等不良后果,给机体带来严重的不良反应。

3、RBCM载药策略

目前,RBCM载体与药物结合的方式主要有三种:①利用完整的红细胞直接装载药物;②利用红细胞制备细胞外囊泡直接包载药物,制成纳米红细胞药物载体;③将分离得到的RBCM包覆于载药纳米颗粒外层,构建仿生纳米载药系统。三种载药方式的示意图见图2。

3.1基于完整红细胞的载药策略

在RBCM纳米药物递送系统的不断发展过程中,研究者们一直致力于寻找提高载药效率和保障红细胞生理功能完整性之间的平衡点。利用完整红细胞作为载体,可以减少对红细胞结构和功能完整性的破坏,在很大程度上保留了长循环所必需的复杂蛋白质组成,从而更好的发挥红细胞的自身优势。主要载药方式有两种:将药物包载入红细胞内和将药物连接到红细胞膜上。

图2基于完整红细胞作为载体、纳米红细胞和RBCM包被的纳米载体的示意图

3.1.1将药物包载入红细胞内

目前,将药物分子包载入红细胞内的方法主要有低渗法、化学物质诱导内吞法、电穿孔法等[22,23,24]。

①低渗法

主要是基于红细胞的渗透特性,将红细胞置于梯度低渗溶液中,使其达到溶血临界点,此时细胞膜上出现200∼500A。的孔洞,药物通过孔洞进入红细胞后再将红细胞转移至等渗溶液中,红细胞恢复正常形态,膜表面孔洞关闭,将药物保留在红细胞内。Harisa等[25]通过此技术将紫杉醇包载入红细胞内,包封率为46.36%,红细胞回收率为75.94%。此外,通过测定包载药物的红细胞、未包载药物的红细胞及生理红细胞的血液学指标,平均红细胞体积依次为(109±1.50)、(96.6±1.30)和(84.5±0.6)fl,我们可以看出红细胞在制备过程会变得很脆弱,并且包载药物后会变得更脆弱。EryDel公司的Magnani[26]设计了名为“RedCellLoaderTM”的红细胞载药专用设备(中国发明专利:CN102985079A;美国发明专利:US2013101463A1)。利用该设备采用低渗预膨胀法可以将地塞米松-21磷酸盐包封进红细胞,用以治疗慢性阻塞性肺病、肺囊性纤维化等疾病。

②化学物质诱导内吞法

是一种利用可诱导红细胞内吞作用的化学物质来使药物包封进红细胞的方法。采用这种方式可将伯氨喹包入红细胞[27];也可包封普伐他汀(Pravastatin),包封率可达94%,红细胞回收率为87%～93%[28]。

值得注意的是,这两种红细胞载药制剂均未涉及体内药动学的研究,即红细胞药物载体的长循环性没有得到证实。同时化学物质诱导内吞方法具有较大的局限性—只能用于包封同时具有疏水基团和亲水基团的阳离子或阴离子药物[29]。

③电穿孔法

基本原理是在等渗溶液中以电击方式诱导红细胞发生渗透性的改变;跨膜电位差导致红细胞上形成孔隙,药物分子从孔隙进入红细胞中[30]。采用此法可将重组人白细胞介素-2包入红细胞,包封率为5%～7.5%[31]。

3.1.2将药物连接到红细胞膜上

在一定程度上,该方法能减小红细胞结构和功能的损害[32],主要的连接方式有化学连接和红细胞搭便车(redbloodcell-Hitchhiking,RH)技术。

①化学连接

是采用基团共轭连接或生物素-亲和素等特异性连接的方式将化学物质连接到红细胞膜的某些靶点上。例如使用非特异性化学交联剂戊二醛将Daunorubicin连接到从5位捐赠者的血液提取分离的红细胞,研究发现,用戊二醛处理的红细胞可以从培养基中快速摄取蒽环类抗生素,例如道诺霉素(Daunorubicin)和多柔比星(Adriamycin,Dox),并且比未处理的细胞更快[33]。

由于表面负载法不需要在红细胞上打孔,因此其损伤比内载法对红细胞的损伤小。但是这种连接方式也存在一定的问题:化学缀合对红细胞的过度修饰阻碍了红细胞的生物相容性。例如,红细胞偶联配体可能干扰靶锚分子的功能,阻断和抑制CD47蛋白并损害其他保护性蛋白;可能改变红细胞的变形性,引发细胞骨架的胞质内变化,并诱导活性氧生成[34,35,36,37]。

②红细胞搭便车(redbloodcell-Hitchhiking,RH)技术

由Brenner等[38]开发,它是将药物纳米颗粒通过静电作用力、范德华力和疏水相互作用力附着于红细胞表面,然后通过静脉注射或者动脉血管插管的方式输注给患者;进入血液循环后,纳米颗粒由于剪切应力或与内皮细胞直接接触而与红细胞解吸附。研究人员在利用动物模型研究后发现,这种技术能明显增加运送至选定器官的药物浓度,可有效改善纳米载体药物肝脾摄取严重、体内靶向性差等药代动力学问题,降低药物潜在的不良反应,提高药物靶向递送效率[39,40,41,42]。但是,RH技术在实际应用中会由于药物纳米颗粒与红细胞连接不牢固而易出现解吸附等问题。

3.2纳米红细胞

微米尺寸的完整红细胞用于实体瘤的治疗或成像时,会限制其血管外扩散能力,减少制剂直接接近肿瘤细胞的机会,使药物靶向递送到肿瘤部位的机率大大减少。为了解决这个问题,研究人员将红细胞制备成纳米红细胞。1994年,Lejeune等[8]报道了RBCM衍生脂质体的制备,即通过物理挤压的方式使RBCM通过具有确定孔径的膜,平均直径在100～200nm之间,此粒径范围可允许通过血管内皮间隙。

纳米红细胞囊泡的制备方法一般有物理挤出和超声处理两种(见图3)。挤出法制备纳米红细胞,一般是在37℃恒温控制的挤压装置中,RBCM悬液在氮气压力下连续通过聚碳酸酯膜挤出8～10次。超声处理法是使用探针或水浴超声处理器将RBCM转换成小囊泡。

图3使用挤出和超声处理方法制造纳米红细胞

与完整红细胞载药方式相似,纳米红细胞的药物结合(装载)方式也有两种。一种是将药物修饰在RBCM表面。例如,将抗疟药物乙胺嘧啶缀合偶联在RBCM表面[43]。但研究发现,载药的纳米红细胞在1h内会快速累积于肝脏等器官中(18.71±2.20)mg·L-1,比游离药物高出近40%(12.82±1.21)mg·L-1[43]。与游离药物相比,红细胞载药的循环时间没有得到延长。另一种方式是将药物包封在纳米红细胞中。Gupta等[44]将用于肺动脉高压吸入治疗的药物——法舒地尔直接包载入纳米红细胞。无论是静脉注射给药途径还是肺部气管给药途径,RBCM包载的法舒地尔半衰期较游离药物均增加了6～8倍。

与完整红细胞载体相比,小尺寸的纳米红细胞更易于渗透出血管、靶向到肿瘤等治疗部位,加之其取自完全的天然生物材料,在理论上其生物相容性更好,免疫原性更低。但是细胞外囊泡的制备以及与药物的结合手段同样都会对红细胞的结构造成很大损伤,严重影响载体药物在体内的长循环性。

3.3RBCM包被纳米制剂的仿生策略

RBCM伪装纳米粒是以纳米颗粒为核心,RBCM为外壳的仿生纳米制剂,可以同时发挥这两类药物载体的各自优势。在这个复合的纳米粒子体系中,常规制备过程分为两个部分:RBCM衍生的囊泡制备和囊泡-颗粒融合[45]。RBCM衍生的囊泡一般通过低渗处理和物理挤出获得。随后以机械挤出的方式将纳米颗粒与RBCM囊泡进行融合。具体实验制备过程:首先将NPs与囊泡超声分散包裹,然后将混合物反复挤出通过不同尺寸的多孔膜。机械力促使纳米颗粒穿过脂质双层,产生囊泡-颗粒融合。在反复挤出后,通过离心除去过量的囊泡,收集的沉淀物为最终产物,通过再分散得到RBC-NPs。

为了验证复合物是否仍然具备红细胞的原有特性,Zhang等[45]对其表面形态、蛋白质等进行了评估。采用动态光散射(DLS)检测RBC-NPs包封前后的纳米颗粒尺寸,文献数据显示NPs的直径在包封后增加大约10～20nm。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯染色对表面蛋白质进行验证,结果表明,RBC-NPs的蛋白质结构与RBCM蛋白质结构保持一致[45]。药物体外释放实验中[46],与PEG修饰的NPs相比,RBCM可以为NPs提供屏障,延缓包埋药物分子向外扩散,RBC-NPs具有更好的药物控释功能。在以急性髓性白血病Kasumi-1细胞系为模型的体外抗癌实验中,与游离Dox相比,RBC-Dox-NPs表现出更高的毒性[46]。

虽然多种膜蛋白在红细胞膜包被载体前后未发生改变,但该验证方式存在一定弊端—SDS-PAGE技术所检测的蛋白质结构并不等同于蛋白质的真实结构。这一技术基于蛋白质亚基分子量不同会导致蛋白质迁移率不同的原理来分离蛋白质。同一条带只能代表蛋白质分子量相同,即蛋白质类别相同,并不能代表决定蛋白质属性的高级结构依然相同。因此,我们需要更新蛋白质结构的验证方法,同时优化制备方法,减少对RBCM结构的破坏。

4、总结与反思

迄今为止,基于RBCM药物递送系统的研究广泛且深入,各种研究均取得了良好的结果,但这一平台能否真正为临床所用还有待考量,仍旧存在诸多潜在问题。

首先,RBCM的来源具有挑战性。红细胞源于生物体,不同来源的红细胞载体本身就具有较大的差异性。目前,文献中所应用的模型均属于动物模型,而人的血液中会有不同种类血型抗原的红细胞差异,所以这一递送系统投入临床使用时需要进行严格的血型匹配和献血者的血液筛查,以最大限度减少异体输血带来的抗原凝集反应等不良后果,这无形中增加了成本与风险。此外,红细胞的体外储存也是一项很大的挑战。血库的储存对环境要求很高,红细胞极易受到氧化等损伤。在药物包封期间维持红细胞中正常的氧化剂/抗氧化剂平衡可能有助于产生与正常红细胞相似特征的载药细胞。但当RBCM中脂质和蛋白质受到损伤,RBCM载体反而会导致药物的加速清除并分布进入非靶器官组织单核吞噬系统的肝脏、脾脏等。其次,在RBCM制剂的制备过程中,“超声分散”产生的局部高温和金属脱落物等对蛋白质高级结构造成的破坏、挤压过程中导致的膜成分重新分布等,均使细胞膜在组成上无法与原细胞膜保持一致。难以保证细胞膜的完整性会对RBCM发挥载体优势带来很大影响,原因如下:第一,唾液酸(sialicacid,SA)对于红细胞载体的长循环特性起着关键作用。红细胞在经唾液酸酶处理后,寿命会从原来的120天锐减到短短数小时[47]。SA作为细胞负电荷的主要来源,它的丢失会使膜彼此间斥力减小,相对引力增加,影响RBCM的微观流变特性,使RBCM剪切弹性模量增大,表面粘度增加[48]。失去SA的红细胞载体会对药物在体内的运输产生负面影响。第二,膜磷脂成分的重新分布也是这一载药体系的“半路杀手”,它会将膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)暴露量增加几个数量级,从正常水平<0.5%增加到>5%[49]。PS是红细胞衰老或受损后被机体识别清除的信号分子,是MPS识别RBCM脂质体模型的决定因素[50]。有研究表明[51],与RBCM外侧相似的脂质体在很大程度上避免了MPS的识别和清除。但是当加入>2mol%PS成分修饰模型时,制剂在小鼠血液循环中的存留能力大大降低。因此这些结构不再完整的红细胞会被内皮细胞或补体黏附,进入微血管系统(尤其是肺部),引发吞噬清除,使RBCM的隐形性丧失。更为严重的是,大量的RBCM包载药物进入血液后,会引起吞噬细胞的超载负荷,这一情况可能会负反馈地阻碍吞噬细胞的重要宿主防御功能,包括杀菌和抗原呈递功能,对我们身体局部或全身带来一定的不良反应[49]。因此,如何减小对RBCM的损伤及如何使RBCM的制备工艺化和标准化是我们亟待解决的问题。

此外,疾病的典型病理因素可能改变基于红细胞的药物递送系统的行为和效果。例如,局部和全身水平的细胞因子、其他炎症介质可能导致补体调理作用的激活与增强,使红细胞凝集和粘附加重,易诱导免疫系统的识别吞噬作用。内皮细胞和血脑屏障的通透性增强可导致载药红细胞外渗至隐蔽性水肿和/或出血部位,在这些非预期区域产生脱靶效应,使红细胞所负载的药物引发毒副作用或其他问题。再者,血液介质的粘度[52,53]、流场切变率的大小[54]等外在因素会严重影响RBCM的剪切弹性模量。在血液粘度较大、切变率较高的患者体内,红细胞的变形性会下降,对红细胞载药体系的运输造成很大干扰。红细胞的运输对于药物的药代动力学、分布以及与预期和非预期目标相互作用的能力方面也会产生巨大的变化。如何进一步提高药物的包封率、靶向性和控释性,避免由于药物泄漏和脱靶释放等对身体带来严重不良反应,是我们目前面临的巨大挑战。

综上所述,我们对基于RBCM的纳米药物递送系统进行了反思,认为这一平台存在可以优化改进的地方,也存在诸多本质上不能避免发生的情况,极大地限制了该系统的发展。创新性思维策略的发现对于科研是至关重要的,但面对新事物的涌入我们不能盲目向往,需要全面理性地分析新策略的优势与不足,探索更加合理可行的措施。希望此文可以为药物递送系统领域的发展提供一定的参考,激起研究者们对RBCM药物递送系统的进一步探索,使其更好地应用服务于医药领域。

陈萌,刘梦阳,张琦,宋艳志,刘欣荣,邓意辉.红细胞膜药物递送系统的研究进展与反思[J].沈阳药科大学学报,2020,37(06):556-563.