近些年,靶向药物递送系统在药剂学的研究中占据重要地位,DDS可以使药物运送到特定的病变位置,在局部形成相对高的药物浓度,减少对正常组织的损害,从而提高药物的治疗效果,降低毒副作用[1,2]。然而,DDS仍然具有一定的局限性,主要体现在靶向递送系统给药后到达靶部位前,载药体系中的药物会发生提前释放(泄漏)等问题。为了解决这些问题,刺激响应型载药系统受到药剂学学者们的广泛关注,刺激响应型载药系统可以根据外界环境刺激条件的变化,从而实现DDS的刺激响应型释药。外界的刺激可以是pH值[3,4,5]、氧化还原、酶[6]、温度[7]、光[8]和糖等。在众多的刺激响应型递送系统中,由于肿瘤组织的缺氧环境使乳酸大量堆积而无法排除,因此肿瘤组织具有pH较低的微酸性环境,这使得pH响应型的纳米载体被广泛地应用于药物载体研究中。

现如今,传统的化学治疗方法在肿瘤的治疗中具有一定的局限性,药物在杀死肿瘤细胞的同时也会损伤正常细胞,同时单独的化学治疗方法已经不能满足人类治疗肿瘤的需求。因此急需找到一种新的治疗方法,能避免药物递送系统在到达肿瘤部位前的提前释药,并且治疗方法对人体更加有效安全。作为一种新兴疗法,光热治疗(photothermaltherapy,PTT)逐渐走进人们的视线,PTT是利用具有较高光热转换效率的材料,利用波长在700～1100nm的NIR光具有较高的穿透效率,使载体在外部NIR光源的照射下将光能转化为热能,使载体的温度升高,促进药物快速释放,实现NIR响应型释药。刺激响应型递送系统不仅可以增加药物对病灶组织的疗效,还可以降低给药剂量,降低药物对正常组织的毒副作用。因此设计兼具靶向性和响应型的药物递送体系用来治疗癌症,降低毒性提高生物利用度已成为一种趋势。

相比于传统的载药体系(如有机聚合物、脂质体),作为原始碳载体的介孔碳纳米粒具有独特的理化特性,如比表面积和孔体积较大,孔径大小均一可调,低毒性,表面易于修饰等。此外,MCN与其他载体相比,MCN作为一种良好的近红外(NIR)吸收剂,它可以吸收NIR的照射输出,将能量转换为热量,并且MCN具有较高的光热转换效率,可以作为化疗-光热治疗的协同治疗载体。本文作者选择MCN作为药物的载体,利用载体的介孔孔道结构,实现药物的高效装载,研究将聚乙二醇接枝到载体的表面,使体系生物相容性得以提高。研究将抗癌药物阿霉素装载在载体内部,该体系具有pH响应型和NIR双重响应型药物释药特征。使其具有刺激响应释放的效果,有效减少药物的提前释放,提高治疗效果[9,10]。

1、仪器与材料

TecnaiG20透射电子显微镜(美国FEI公司),V-sorb2800P比表面积及孔径分析仪(北京金埃谱科技有限公司),Zs-90马尔文粒径和电位仪(英国马尔文仪器有限公司),DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义予华仪器有限公司),TDL-6A离心机(上海菲怡尔仪器有限公司),AL104电子天平(MettlerToledo仪器上海有限公司),ZHWY-103B恒温培养振荡箱(上海智诚分析仪器制造有限公司),SGL-1700高温管式炉(中国科学院上海光学精密器械研究所),烘箱(上海博讯实业有限公司)。

十六烷基三甲基氯化铵(国药集团化学试剂有限公司),无水乙醇(天津富宇精细化工有限公司),阿霉素(doxorubicin,DOX,质量分数为99%)、聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)、正硅酸乙酯(tetraethoxysilane,TEOS)、间苯二酚(天津博迪化工有限公司),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS),上海阿拉丁试剂有限公司),甲醛(沈阳经济技术开发区试剂厂),其他试剂均为分析级由山东禹王试剂有限公司提供。

2、方法与结果

2.1MCN-COOH的制备与表征

2.1.1MCN的制备

首先配制重量分数为质量分数25%的十六烷基三甲基氯化铵溶液:将10gCTAC加入到30mL蒸馏水中,过夜磁力搅拌(500r·min-1)使CTAC完全溶解。将19mL蒸馏水,4mL无水乙醇和1.04gCTAC溶液加入锥形瓶中,在25℃条件下搅拌30min后,加入0.2g的间苯二酚并继续搅拌30min。量取0.36mL正硅酸乙酯(tetraethoxysilane,TEOS)和0.28mL甲醛溶液逐滴加入到上述反应液中,置于水浴锅中加热至30℃,持续搅拌24h。反应结束后,离心收集沉淀,弃去上清液,用蒸馏水和无水乙醇各洗3次,收集沉淀物在60℃烘箱中烘干。将得到的固体研磨、过筛,在N2条件下700℃高温碳化3h,得到碳硅混合物,将碳硅混合物在体积分数10%的氢氟酸溶液中浸泡24h除去硅模板,将溶液抽滤,收集沉淀物并干燥即得球形介孔碳载体,备用。

2.1.2MCN-COOH的制备

为了利于后续修饰聚合物,本研究作者将载体进行了羧基化修饰。通过氧化处理,在疏水的介孔碳表面引入亲水性的羧基基团,操作过程如下:将200mgMCN加至装有12mL新鲜配制的APS溶液的圆底烧瓶中,60℃下搅拌回流3h,抽滤并真空干燥。APS溶液是用2molH2SO4溶液配制的含1mol(NH4)2S2O8的氧化剂。

2.1.3MCN和MCN-COOH分散性考察

分别称量20mgMCN和MCN-COOH载体置于5mL蒸馏水中,超声分散最终分别得到浓度为4g·L-1的MCN和MCN-COOH混悬液。将两种混悬液放置在两个相同的西林瓶中,静置,观察现象。最终结果如图1所示,与MCN相比,当载体经过羧基修饰后,载体的亲水性增强,在水溶液中分散稳定性增强。

图1MCN(左)和MCN-COOH(右)分散在蒸馏水中的图片

2.1.4透射电子显微镜表征

采用透射电镜对载体的形貌进行表征,称取适量MCN-COOH粉末样品超声分散在蒸馏水中,将样品溶液滴于碳支持膜上。然后将碳支持膜置于样品操作台上抽真空处理,设置加速电压为200kV。MCN-COOH的TEM图片如图2所示,从MCN-COOH的TEM图片中可以清晰地看出载体近似球形,粒径在100nm左右,且分布较为均匀。

图2MCN-COOH的透射电镜图片

2.2PEG修饰的MCN(MCN-PEG)的制备与表征

2.2.1MCN-PEG的制备

为了增加载体的分散性和生物相容性,研究进一步将PEG修饰在载体的表面。具体操作如下:将100mg的MCN-COOH分散在20mLpH7.4的PBS中,加入60mgEDC和40mgNHS活化羧基,1h后将20mg氨基化的PEG加入到上述溶液中,继续搅拌24h,离心,水洗,醇洗,干燥,得到的产品即为MCN-PEG。

2.2.2比表面积和孔径分布表征

利用比表面积及孔径分析仪对上述过程所制备得到的MCN-COOH和MCN-PEG载体进行测试分析。首先将约80mg样品在120℃的真空环境中进行脱气3h处理,然后利用brunauer-emmett-teller(BET)法在相对压力为0.05到0.20内计算比表面积。根据吸附等温线脱附支数据,用barrett-joyner-halenda(BJH)模型计算孔径分布和孔体积。

MCN-COOH及MCN-PEG的吸附-解吸附等温线和孔径分布曲线如图3所示。从图可看出,制备载体的氮气吸附-解吸附等温线有一个较小的回滞环,为Ⅳ型等温线,符合典型的介孔物质的吸附曲线,研究通过吸附和脱附两个分支,结合BET模型和BJH模型计算得到载体的比表面积(SBET)、孔径分布(WBJH)和孔体积(Vt),结果见表1。从表可以看出,载体PEG修饰后,载体的SBET和Vt略微降低,但WBJH未发生明显变化,说明由于载体PEG修饰后,载体的孔道没有被堵住,而PEG修饰后的载体重量有所增加,使得单位重量的比表面积和孔体积降低。

图3MCN,MCN-COOH和MCN-PEG的(A)氮气吸附/脱附图和(B)孔径分布图

表1MCN-COOH和MCN-PEG样品的吸附-解吸参数

2.2.3Zeta电位分析

分别将MCN-COOH,MCN-PEG置于蒸馏水中,超声分散,于25℃下测定各个样品的Zeta电位。对于MCN-COOH载体,由于-COOH本身具有负电性,Zeta电位测定值为-33.5mV,当氨基化PEG共价修饰在载体表面后,MCN-PEG的Zeta电位变为-12.7,主要是由于MCN-COOH中有大量的羧基,一部分羧基与氨基化PEG共价反应,剩余的羧基仍然存在,使得MCN-PEG的载体表面仍为负值。

2.3NIR诱导光热效应研究的体外评价

为了进一步研究MCN-PEG的体外升温效果,用近红外激光器照射样品混悬液进行研究。将MCN-PEG分散在蒸馏水中使其质量浓度为100mg·L-1。用移液枪吸取200μLMCN-PEG混悬液置于0.5mLEP管中。设置激光器功率为2W·cm-2,照射3min,实时记录温度变化情况。图4直观显示了MCN-PEG混悬液的升温效果。以蒸馏水为空白对照,照射3min后,MCN-PEG的样品混悬液能够升高至61.3℃,证明体系升温效果良好。此外,作者进一步研究了不同质量浓度MCN-PEG混悬液(5～100mg·L-1)的体外升温效果,结果如图5所示。设置近红外激光功率为1W·cm-2,蒸馏水在3min内温度没有明显变化,因此以蒸馏水作为空白对照。当MCN-PEG混悬液照射3min后,温度逐渐升高,并且随着MCN-PEG浓度的增大,升温效果逐渐增强,当MCN-PEG混悬液的浓度为100mg·L-1时,在3min内温度可以从20℃升至将近50℃,表明体系具有浓度依赖性光热转换能力。之后,选择浓度为100mg·L-1的MCN-PEG混悬液,研究不同激光功率密度下的MCN-PEG混悬液的升温特性。设置激光功率分别为0.25、0.5、0.75、1.0和2.0W·cm-2。随着照射功率的逐渐增强,载体的升温特性也逐渐增大。当用2W·cm-2照射MCN-PEG混悬液3min时,温度从30℃升高到65℃。升温效果明显。此外,我们选择100mg·L-1的MCN-PEG混悬液用2.0W·cm-2的功率对其进行反复照射。结果如图6所示,当经过5次的NIR照射开/关循环后,样品依旧保持升温特性。表明载体的升温性质并未发生变化。从上述讨论可以看出,MCN-PEG具有良好的光热转换能力,且光热转换能力和溶液浓度和近红外光照射功率正性相关,并且,MCN-PEG经过多次反复照射后,依旧具有升温特性。也就是说,MCN-PEG纳米复合材料适用于化疗-热疗的联合应用中。

图4蒸馏水和MCN-PEG悬浮液的照片及蒸馏水和MCN-PEG悬浮液在2W·cm-2下照射3min的热升温图像

图5在2W·cm-2的功率密度下照射的不同浓度的MCN-PEG悬浮液的NIR诱导的发热(A),在不同激光功率下照射的50mg·L-1MCN-PEG悬浮液的NIR诱导的发热(B)

图6加热MCN-PEG悬浮液,用于在2W·cm-2功率密度下暴露于激光的五次NIR照射开/关循环

2.4载药体系的制备过程

选择抗癌药物DOX作为模型药物装载入MCN的孔道中,采用吸附平衡法进行载药试验。具体过程如下:将25mgDOX溶解到8mL蒸馏水中,加入30mgMCN-PEG,超声0.5h后,继续室温避光搅拌24h,离心分离样品,并用pH5.0PBS洗去吸附在载体表面的DOX。装载DOX后的MCN-PEG纳米粒记作DOX/MCN-PEG。

2.5载药量的测定

由于DOX与MCN载体的相互作用较强,使得载体内部的药物不能全部释放出来。所以载药体系的载药量采用减量法计算,用最初投入DOX的总量减去在载药和接枝过程中每一步损失DOX的重量,即得到装载在载体内部的载药量。研究采用UV-vis法于490nm波长处定量测定上清液中DOX的质量浓度,从而计算出DOX/MCN-PEG中的载药量。DOX/MCN-PEG中DOX的载药量为(31.1±3.6)%,这是由于MCN载体内部存在较大的介孔孔道结构,从而使MCN载体具有较高的载药量[11]。

2.6药物存在状态的表征

研究使用X射线衍射仪对DOX/MCN-PEG中DOX的物理状态进行进一步表征。如图7所示,DOX原料药呈现出典型且明显的晶体衍射峰形。然而由于MCN介孔孔道的逆晶作用[12],DOX将以非晶状态存在于介孔孔道中,所以DOX/MCN-PEG样品的测试结果未出现任何晶体衍射峰,与未载DOX的MCN-PEG样品测试结果基本一致,说明DOX以非晶装载存在于MCN-PEG载体中。

图7DOX,MCN-PEG和DOX/MCN-PEG的XRD表征图

2.7pH和NIR双重响应型药物释放

为了考察DOX/MCN-PEG体系的药物释放特点,称量3mgDOX/MCN-PEG分别分散在9mLpH5.0PBS和pH7.4PBS的释放介质中,将样品放置于恒温摇床中,设置摇床参数为37℃,135r·min-1。在不同的时间点取出样品,离心,在480nm的UV-Vis中测定其吸光度。对于NIR组,唯一的区别为分别在1、4和9h的时间点对样品进行NIR照射5min,设置照射功率为3W·cm-2。

图8DOX/MCN-PEG在有/无NIR照射条件下在pH7.4PBS和pH5.0PBS中的释放曲线(3W·cm-2功率密度下照射5min)

由图8可得,药物在pH7.4PBS中12h的累积释放量约为11%,然而在pH5.0PBS中,药物在相同时间的累积释放量可达到30%,表明该体系具有pH敏感型释药特征。此外,无论在pH7.4PBS还是pH5.0PBS的释放介质中,经NIR照射后药物的释放均呈阶梯式增加。在pH5.0PBS中,经NIR照射后,药物的累积释放率是未照射条件下的1.8倍,其在12h内的释放量可超过50%。在pH7.4PBS中,药物的释放速率呈现出相似的结果。由以上数据可初步判断NIR照射可促进药物的释放速度。

2.8溶血性实验

为了评价介孔碳载体修饰PEG后,体系的生物相容性,研究进行了溶血性实验。用水合氯醛麻醉家兔,心脏取血,将取出的血液置于涂有肝素的离心管中,离心(1000r·min-1,10min),弃上清液,用生理盐水洗至上清液无色,用生理盐水将剩余的红细胞稀释成体积分数为2%的红细胞混悬液。将2%的红细胞混悬液与等体积的含有载体的生理盐水溶液混合,使MCN-COOH和MCN-PEG样品的最终浓度分别为20,50,100,250,500和1000mg·L-1,加入生理盐水和蒸馏水的红细胞样品分别用作阴性和阳性对照。静置4h,离心(1800r·min-1,10min),将上澄清溶液于541nm波长下测定吸光度。溶血百分率(%)=(样品的吸光度-阴性对照的吸光度)/(阳性对照的吸光度-阴性对照的吸光度)×100。

MCN-COOH和MCN-PEG载体在浓度为20至1000mg·L-1内的溶血百分率见图9。MCN-COOH载体的溶血百分率与浓度呈明显的依赖关系,当浓度为500和1000mg·L-1时,载体的溶血百分率分别为19.6%和33.5%,这是由于羧基化碳载体的强吸附性以及羧基化碳载体和红细胞膜表面蛋白之间的静电相互作用产生的。而对于修饰PEG的MCN-PEG载体,即使在最高浓度为1000mg·L-1时,样品的溶血百分率仍然不足2%,结果说明在介孔碳载体表面修饰PEG可以明显地降低载体的溶血率,提高介孔碳载体的生物相容性[13]。

图9不同质量浓度下MCN-COOH和MCN-PEG的溶血百分率

3、讨论

3.1NIR响应型药物释放

当用近红外光照射载药体系后,药物释放量呈现阶梯式的增长。这是由于MCN的光热转换能力较强,可以将近红外光能高效的转换为热能,且MCN-PEG仍具有较高的光热转换效率。当用近红外光照射载药体系后,载药体系产生的热能可以使释放介质的温度升高,可减弱DOX与载体间的静电作用力和π-π堆积力,从而加速药物的释放。

3.2pH响应型型药物释放

药物释放试验结果表明,体系在pH5.0PBS中的药物释放量大于药物在pH7.4PBS中的药物释放量。这是由于DOX的pKa是8.2,在pH7.4的PBS溶液中带正电[14,15]。而MSN-PEG上存在羧基基团,MSN-PEG与DOX在pH7.4PBS中有较强的静电相互作用,而在弱酸性环境中(pH5.0PBS)中相互作用较弱,从而加速药物的释药[13]。

4、结论

本项目利用介孔碳载体的特殊结构特点和孔道特征,在实现药物高效装载与稳定分散的基础上,将高分子聚合物聚乙二醇接枝于载体的介孔孔道表面,可增加载体的生物相容性和分散性,为解决靶向药物递送系统的低载药量以及单纯化疗药物毒副作用大的问题供了探索性的思路。同时MCN载体本身具有较高的光热转换效率,在NIR照射下,可以将光能转化为热能,从而杀死肿瘤细胞。此外载体体系还具有pH和NIR双重响应型药物释放的特点,为体系在热化疗的联合应用中奠定了基础。

沙天健,林琳,高源,赵沛栩,史馨语,赵勤富.近红外和pH双重响应的介孔碳药物递送系统的制备与初步评价[J].沈阳药科大学学报,2020,37(06):481-487.

基金:国家自然科学基金面上项目(81603058);辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201710163000073).