拉洛他赛是新一代的紫杉烷类抗肿瘤药物，通过与微管内表面蛋白结合使微管结构稳定，抑制微管在正常有丝分裂过程中的解聚，从而使细胞滞留在晚期即G2/M期，导致细胞死亡。与紫杉醇、多西他赛相比，拉洛他赛具有更低的P-gp及CYP450亲和力，对常见的肿瘤细胞及多种耐药基因表达的肿瘤细胞如人体乳腺癌耐多柔比星细胞株MCF-7/Doxrubicin、人体肺癌耐紫杉醇细胞株A549/Taxol等也具有较高活性的抑制作用[1]。包括拉洛他赛在内的紫杉烷类药物均属于BCSIV类药物，同时具有较低的水溶性和肠道渗透性，而大部分上市的制剂也多为注射给药，目前处于临床试验阶段的拉洛他赛脂质微球也为注射剂。通常注射剂为了解决这些药物水难溶性问题会在处方中加入乙醇及低分子量表面活性剂，而这些表面活性剂直接进入体循环会带来很多严重的超敏、体液潴留等不良反应[2]。而口服制剂作为最方便的给药方式，具有成本低、顺应性高等特点[3]，因此考虑将拉洛他赛制备为口服制剂。

自乳化释药系统是由药物、油相（oil）、表面活性剂（surfactant）和助表面活性剂组成的均一、稳定透明的液体给药系统。自乳化释药系统可增加难溶性药物的溶解度，提高药物的吸收速度和程度，以此来提高生物利用度，是极具潜力的一种新型亲脂性药物载体。其主要的特征是在体温下经胃肠道蠕动或体外环境温度适宜以及温和搅拌的情况下，在表面活性剂的作用下自发乳化形成粒径小于5µm的O/W型乳剂[4,5]，且随着表面活性剂和助表面活性剂的含量增加会得到乳滴粒径更小（粒径<100nm）的透明澄清乳液[6]。韩国科学技术研究院所研制的紫杉醇自乳化释药系统口服绝对生物利用度可达30%，现已进入三期临床试验阶段，可见抗肿瘤药物的自乳化释药系统具有广阔的应用前景。作者选用低毒性的油相和表面活性剂以及具有肠道黏膜黏附性的单油酸甘油酯制备拉洛他赛自乳化释药系统并考察其理化性质和稳定性，研究其在大鼠体内的药代动力学，目的希望能提高拉洛他赛的口服生物利用度。

1、仪器与材料

ACCULABATL-124分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），L-2000高效液相色谱仪（日本Hitachi公司），pH-10酸度计（德国Sartorius生物技术有限公司），KQ-300DE超声清洗器、ZHWY-110X30水浴恒温培养摇床（上海智城分析仪器制造有限公司），DF-101s集热式恒温磁力搅拌器（巩义英峪予华仪器厂），马尔文粒度测定仪（英国Malvern公司），EYELAOSB-2100旋转蒸发器（日本东京理化器械株式会社），高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），BA300Pol偏光显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），ACQUITYTMUPLC系统（WatersCorp.Milford,MA,USA),WatersACQUITYTMTQDUPLC/MS/MS(WatersCorp.Manchester,UK）。

拉洛他赛（larotaxel,LTX，山东靶点药物研究有限公司），LTX-SEDDS（自制），多西他赛（上海三维药业有限公司），单油酸甘油酯（嘉法狮上海贸易有限公司），三辛酸甘油酯（美国Sigma公司），吐温80（上海申宇医药化工有限公司），胃蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司），胰蛋白酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），二氯甲烷（分析纯，天津富宇化学试剂有限公司），甲醇、乙腈（色谱纯，市售），其余试剂（分析纯，市售），水为蒸馏水（自制）。

动物为雄性Sprague-Dawley(SD）大鼠，体质量为200～220g，由沈阳药科大学动物实验中心提供，合格证号SCXK（辽）2015-0001。

2、方法与结果

2.1LTX-SEDDS制备

2.1.1LTX在各种辅料中溶解度的测定

将过量的LTX原料药分别加入到盛有各种油相和表面活性剂的具塞玻璃试管中，制成LTX饱和溶液，涡旋后，置于37℃的水浴恒温培养摇床中震荡平衡72h，置于室温下平衡后取上清并于1.2×104r·min-1离心20min，精密吸取一定量并选择适宜的溶剂稀释后，分别用0.22µm微孔滤膜过滤后进行含量测定，计算溶解度，结果见表1。

表1LTX在不同溶剂中的平衡溶解度（37℃，n=3)

表1结果表明，在油相溶剂中，LTX在三辛酸甘油酯中溶解度最大，选择三辛酸甘油酯作为油相，LTX在单油酸甘油酯中溶解度虽然没有很大，但是由于单油酸甘油酯具有肠道黏膜黏附性的作用，有利于增加药物的吸收，因此将单油酸甘油酯与三辛酸甘油酯共同作为油相。在表面活性剂中，LTX在吐温80中溶解度相对较大，固选择吐温80作为表面活性剂。

2.1.2LTX-SEDDS伪三元相图的绘制

根据LTX在各种辅料中的溶解度实验结果，分别选择油相和表面活性剂中对药物溶解度最好的三辛酸甘油酯和吐温80作为油相和乳化剂，并选择具有肠道黏膜黏附作用的单油酸甘油酯联合使用，配置一系列不同比例的单油酸甘油酯和三辛酸甘油酯的混合物，将其与表面活性剂按不同的质量分数置于具塞玻璃试管中涡旋混匀，在37℃、50r·min-1温和搅拌下逐渐加入定量的蒸馏水，参照多数文献采用的自乳化制剂的评价方法即目测法对成乳情况进行初步评价，将自乳化情况分为5个级别[7]:A级为溶液呈澄清或微泛蓝色；B级为略浊，呈蓝白色；C级为呈亮白色不透明液体；D级为色泽暗，呈灰白色，略带油状；E级为难乳化，一直有油滴存在。记录不同比例混合系统的变化情况和状态，分别以单油酸甘油酯、三辛酸甘油酯和吐温80作为相图的3个顶点，绘制伪三元相图，结果见图1。

图1结果表明，A、B、C、D和E的不同区域分别对应自乳化情况的5个等级，从图中可知，当吐温80的质量分数低于25%时，会一直有油滴存在，很难形成乳剂，随着吐温80量不断增加，乳剂越容易形成，当吐温80的质量分数>40%时，乳剂反而会更不稳定，渐渐出现分层现象，测得的粒径也偏大；当单油酸甘油酯含量较高时，形成的乳剂很容易出现肉眼可见的略带油滴的状态，所测得的乳剂粒径分散且偏大，约为1µm，稳定性很差；而当三辛酸甘油酯的质量分数<50%时，虽然能形成乳剂，但当放置4h后会出现分层，粒径增大，甚者破乳出现油滴的状态，因此从制剂的稳定性和安全性出发，将吐温80的质量分数范围初步定为25%～40%，单油酸甘油酯的质量分数为5%～20%，三辛酸甘油酯的质量分数为50%～65%，并选择其中A等级中的处方利用均匀设计表进一步优化处方。

图1LTX-SEDDS伪三元相图

2.1.3LTX-SEDDS处方优化

选择相图中自乳化级别为A的区域，使用均匀设计U4(43)表，即3因素4水平下设计得到如表2的4个处方，配制总量为1g的自微乳，每种处方中拉洛他赛的含量均为10mg，其他成分按照总量的百分比称取，分别按照制备方法得到拉洛他赛自乳化制剂。取0.2g的LTX-SEDDS于37℃、50r·min-1温和搅拌15min，并以自乳化后的粒径、电位、自乳化时间、是否能形成均一稳定的制剂为指标选择最优处方，结果见表2。

表2LTX-SEDDS处方优化实验

以粒径大小、制剂自乳化后的稳定性以及自乳化时间作为考察指标对上述实验设计的各个处方实验后进行对比，结果发现，处方1～4（表2），各自乳化制剂均为微微泛蓝色乳光的溶液，但处方1和4经蒸馏水稀释100倍后，24h内乳剂缓慢分层，有药物析出，粒径偏大且较为分散，自乳化时间也偏长；处方2和3在24h内均未出现分层，无药物析出，较为稳定，对比处方2和3的各项指标发现，两者乳化时间接近，处方2具有较小的粒径，且具有较低含量的表面活性剂（30%），因此考虑到粒径大小和表面活性剂的用量，选择处方2作为较优处方。因此最佳处方定为（质量分数）：单油酸甘油酯为15%，三辛酸甘油酯为55%，吐温80为30%，拉洛他赛占总处方质量的1%，并以此处方制备3批LTX-SEDDS。

2.1.4LTX-SEDDS的制备工艺

精密称取三辛酸甘油酯0.55g和拉洛他赛原料药10mg置于圆底烧瓶中，加入适量的二氯甲烷超声溶解后，30℃旋蒸1h除去有机溶剂，再将单油酸甘油酯0.15g和吐温800.3g溶解其中后涡旋混合均匀，制成总质量约为1g的拉洛他赛自乳化制剂，真空再次除去残留溶剂（30℃，1h），即得。

2.2LTX-SEDDS的质量评价

2.2.1外观性状

观察3批LTX-SEDDS制剂以及经模拟胃液、肠液和蒸馏水稀释、温和搅拌下形成微乳后的外观形状，结果见图2。

图2LTX-SEDDS的外观性状（从左至右依次为模拟胃液、模拟肠液和蒸馏水，n=3)

3批LTX-SEDDS均为淡黄色澄清透明的黏稠液体。经模拟胃液、肠液和蒸馏水在温和搅拌形成微乳后，均为澄明或略带淡蓝色乳光的液体。

2.2.2粒径分布以及zeta电位的测定

配置自微乳的溶液约3mL，采用马尔文粒度测定仪对制备的自微乳的粒度分布及zeta电位进行测定，结果见图3、4。

图3LTX-SEDDS自乳化后粒径分布

图4LTX-SEDDS自乳化后Zeta电位分布

用马尔文粒度测定仪测定自微乳的粒径为（169.7±15.36)nm(n=3），多分散性指数PDI为0.169,zeta电位为（-24.2±1.23)mV(n=3)。

2.2.3自乳化时间的测定

于恒温磁力搅拌37℃、50r·min-1下向盛有0.2g的油相混合物的自乳化制剂分别缓慢加入100mL蒸馏水、模拟胃液和模拟肠液3种分散介质，进行自乳化，等到分散介质完全注入后开始计时，分别每隔1min取样3.5mL，至15min，在检测波长为700nm下测定透光率（T），将15min时透光率记为T0，为100%，以此计算出各个时间点透光率的相对百分率，并对乳化时间t作图，考察LTX-SEDDS自乳化速率，并观察在不同分散介质中的自乳化时间，结果见图5。

图5拉洛他赛自微乳在不同介质中的自乳化时间

实验中采用透光率来衡量自微乳的自乳化时间，由图5可以看出，在不同的分散介质中自微乳在温和搅拌的条件下，3min内透光率都趋于稳定，与15min相比，自乳化速率均可达到100%，这表明该制剂在3min内能达到完全乳化分散。

2.2.4偏光显微镜的观察结果

实验中选择偏光显微镜主要是用来定性判定自乳化制剂中有无药物析出，将油相混合物的自微乳制剂和自微乳分散体制片，24h后在偏光显微镜下观察，结果见图6。

图6LTX原料药（A）、24h后LTX-SEDDS(B）和乳化后24h的LTX-SEDDS(C）的偏光显微镜图

由图6A可以看出，拉洛他赛在偏光显微镜下观察到偏光现象，根据已做过的研究发现制备自乳化制剂的辅料没有观察到偏光现象，图6B和6C可以看出，偏光显微镜下观察发现油相混合物的自乳化制剂和经乳化后的自微乳制剂在暗视野下均未观察到偏光现象。结果表明24h后拉洛他赛都能完全分散于油相中，没有药物沉淀析出，说明形成的自微乳制剂能较好地包裹药物。

2.2.5含量测定

色谱条件：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm,5µm），流动相为乙腈-水（体积比65∶35），流速为1.0mL·min-1，检测波长230nm，柱温25℃，进样量10µL。

方法学验证：参照拉洛他赛的质量标准含量测定方法进行方法学实验。结果表明，LTX的空白自微乳不干扰测定，在该实验条件下，LTX的最低检测限为50ng,LTX的保留时间为7.070min，得到的标准曲线方程为A=24.931ρ+15.124(R2=0.9996)(n=3），平均回收率为100.1%,RSD%为0.11%，表明高、中、低浓度下的回收率良好。分别测定了溶液在室温和37℃条件下的稳定性，结果表明拉洛他赛非常稳定，测定仪器和方法精密度也符合要求，RSD分别1.15%和0.66%，经方法学验证表明可用于拉洛他赛自乳化制剂的含量测定。

精密称取适量的拉洛他赛自微乳制剂，甲醇稀释后经微孔滤膜过滤后按上述色谱条件进样测定，计算含量质量分数为（0.987±0.0183)%(n=3）。

2.2.6稳定性考察

2.2.6.1胃肠道稳定性

取自微乳制剂1mL分别加入到2mL的模拟胃液、肠液中，涡旋混匀1min，然后置于水浴摇床中37℃孵育，分别在模拟胃液中孵育0、0.5、1、2、4h和模拟肠液中孵育0、1、2、4、6、8h时间点取样200µL，将上述样品加入5倍冰甲醇终止反应，涡旋混匀1min，取样适量，1.2×104r·min-1冷冻离心（4℃）10min，取上清液，进样分析。

按照胃肠道稳定性实验的方法，以0h样品的峰面积为100%计算，经过4h孵育后，模拟胃液中拉洛他赛的剩余百分率为100.50%,4h后的粒径为177.0nm，经过在模拟肠液中8h孵育发现拉洛他赛的剩余百分率为99.70%,8h后的粒径为172.7nm。药物的剩余百分率结果见图7。由图7可知，拉洛他赛自微乳制剂在模拟胃液中4h和模拟肠液中8h内药物含量在98%～102%，基本没有明显变化，粒径大小也基本没有变化，表明制备的自微乳制剂在进入胃肠道自乳化后不受分散介质的影响，能保持稳定的状态。

图7LTX-SEDDS在模拟胃肠液中的稳定性（37℃，n=3)

2.2.6.2稀释体积对LTX-SEDDS稳定性的影响

将LTX-SEDDS0.5g分别用20、50、100mL蒸馏水、模拟胃液和肠液稀释后，于37℃下静置24h，观察分层和相分离；并将稀释后24h的自微乳置于具塞试管中，6000r·min-1离心20min，观察。

LTX-SEDDS分别用不同体积的蒸馏水、模拟胃液和肠液稀释后结果见表3。由表3可知，随着稀释体积的增加，LTX-SEDDS自乳化后24h内均未见有沉淀产生且无分层和相分离现象，且离心20min仍未发生分层，均呈现略带淡蓝色乳光的溶液。

表3不同分散介质和稀释体积对LTX-SEDDS自乳化后稳定性影响（37℃，n=3)

2.3LTX-SEDDS体内药代动力学研究

2.3.1拉洛他赛色谱条件和质谱条件

色谱条件：色谱系统为ACQYUITYTMUPLC系统，色谱柱为ThermoC18柱（50mm×2.1mm,1.7µm），流动相A液为5mmol·L-1醋酸铵水溶液，流动相B液为乙腈，梯度洗脱条件见表4，流速为0.2mL·min-1，柱温为35℃，进样室温度为10℃。

表4超高效液相色谱梯度洗脱条件

质谱条件：采用WATERSACQUITYTM三重四级杆串联质谱仪（WatersCorp.,Manchester,UK)，离子源及检测模式为ESI+，二级锥孔电压2.0V，毛细管电压3.0kV，锥孔电压25V，离子源温度150℃，喷雾气与反吹气为氮气，去溶剂气温度为400℃，其流速为700L·h-1，反吹气流速为50L·h-1，碰撞气为氩气，其流速0.24L·h-1，碰撞能量为10eV，检测及定量方法为多反应监测模式（MRM）。用于定量分析的拉洛他赛和内标的离子反应条件见表5。

表5拉洛他赛及内标物的离子反应条件

2.3.2对照溶液和内标溶液的配制

对照溶液的配制：精密称取拉洛他赛10.00mg，用甲醇配制成质量浓度分别为20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000和50000µg·L-1的系列标准溶液。

内标溶液的配制：精密称取多西他赛10.00mg，用甲醇稀释配制成1mg·L-1的内标溶液，冷藏保存备用。

2.3.3给药方案与血浆样品采集

采用平行对照试验法，10只大鼠随机分成制剂组和溶液组，实验前禁食（不禁水）一夜。分别按照40mg·kg-1的给药剂量对大鼠灌胃拉洛他赛的制剂组和溶液剂组，分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24h，眼眶取血0.5mL，置预先肝素化的1.5mL尖底离心管中，6000r·min-1离心10min，吸取上层血浆于-20℃保存待测。

2.3.4血浆样品的处理与测定

精密吸取血浆样品100µL置于4mLEP管中，加入DTX内标溶液10µL，涡旋1min混匀。加入甲基叔丁基醚2mL涡旋10min进行液液萃取，4000r·min-1离心10min，移取上清液1.8mL置于另一4mLEP管中，40℃下空气吹干。残渣加入乙腈100µL，涡旋5min对其进行复溶，于1.2×104r·min-1离心，吸取上清液进样分析，进样量为5µL。

2.3.5血浆样品的色谱图

拉洛他赛自乳化制剂和溶液剂分别给药后的血浆样品按“2.3.4”条操作，进样5µL，记录色谱图。其中一个典型色谱图如图8所示。

图8给药后拉洛他赛与多西他赛（内标）的血浆样品色谱图

由图8可见，拉洛他赛的保留时间为2.00min，内标多西他赛的保留时间为1.60min，两者峰形良好，分离度较好。

2.3.6血药浓度曲线

口服拉洛他赛自乳化制剂和溶液剂后，UPLC-MS-MS所测得的血药-质量浓度时间曲线如图9所示。

图9LTX-SEDDS（口服，40mg·kg-1）和LTX-Sol（口服，40mg·kg-1）的血药浓度-时间曲线

2.3.7血药浓度数据分析

采用DAS2软件，将不同时间内血浆质量浓度数据对时间进行拟合，并计算相关药动学参数，结果见表6。

表6LTX-SEDDS（口服，40mg·kg-1）和LTX-Sol（口服，40mg·kg-1）的药动学参数

由图9和表6的数据可知，口服拉洛他赛溶液剂和自乳化制剂后，溶液剂在0.7h达到最大质量浓度176.208µg·L-1，而拉洛他赛自乳化制剂组则延长至3.6h达到ρmax(386.322µg·L-1），这一结果从图9的药时曲线能更直观的看出，且拉洛他赛自乳化制剂组具有更小的分布体积和清除率；能有效的延长体内的平均滞留时间（MRT=4.998h），这可能是由于单油酸甘油酯的加入，使自乳化制剂能黏附在肠壁上，缓慢的发挥疗效；与溶液剂相比，拉洛他赛自乳化制剂的AUC值更高，约为溶液剂组的4.7倍，这也反映出制剂组的相对生物利用度是溶液剂的5倍之多，药物动力学实验结果表明，所制备的具有黏附性的自乳化制剂与溶液剂相比，可以明显提高抗癌药物拉洛他赛的口服生物利用度。

3、讨论

a.通常自乳化释药体系由油相、乳化剂、助乳化剂以及水相构成，油相是影响自微乳形成的重要因素。本实验在油相的选择中，一是考虑到拉洛他赛在三辛酸甘油酯的溶解度很大，二是三辛酸甘油酯的黏度较小，因为当油相的黏度越小，乳化过程就变得越容易，且形成乳剂的粒径也会相对较小，稳定性也会更高。考虑到载药量和稳定性选择三辛酸甘油脂作为油相。而单油酸甘油酯中药物虽然溶解度不是很大，但是由于单油酸甘油酯具有肠道黏膜的黏附作用[8]，有利于增加药物的吸收，提高生物利用度，所以联合使用作为油相。

b.乳化剂是自微乳粒径大小的影响因素，乳化剂常选择毒性较小的非离子型表面活性剂，比如吐温80，具有良好的HLB值，能使油相迅速乳化，且具有抑制P-gp外排药物的作用[9]，增加药物吸收。

c.在处方筛选过程中采用的是大多数自乳化制剂常用的目测法，可能存在主观性，但是可以对处方进行初步的筛选，接着又进行了处方优化，采用的是均匀设计方法，在相应的辅料范围内设计得到几个处方，并以粒径、自乳化后的稳定性以及自乳化时间为三个考察指标。选择均匀设计表只是用来设计处方，并不是用来筛选得到最优处方，因此并没有进行回归分析，并且制剂的稳定性和自乳化时间对辅料无法进行回归分析。因此最终还是以粒径、稳定性和自乳化时间为主要筛选指标。

d.微乳进入胃肠道后遇水会自发形成水包油型的微乳。实验中自微乳的粒径为169.7nm，粒径较常见的自微乳偏大，其原因可能是因为缺少了助乳化剂，因为助乳化剂的主要作用是促进乳化剂对制剂的分散作用[10]。但是助乳化剂也会带来问题，比如会与承载自微乳的硬胶囊壳发生相互作用从而引起硬胶囊壳脆性变大或者变软，造成药物成分可能会透过胶囊壳而发生渗漏，而助乳化剂的损失也会导致制剂对药物的增溶作用减弱，难溶性药物会析出产生沉淀[11]，其次助乳化剂为亲水性物质，可能会与制剂中脂溶性成分产生相溶性问题，从而导致制剂的不稳定，例如储存过程中产生了分层的现象。所以本实验未采用助乳化剂，虽然粒径偏大，但是制剂仍旧是均一稳定的溶液。

e.多数文献采用目测法来观察自乳化体系在溶剂中完全分散形成乳剂所需的时间，即自乳化时间，但是主观上存在较大的差异，评价的准确度不够统一，且形成微乳的方式也会有所不同，本实验中采用的是自乳化速率来评价自微乳的乳化时间，可以不受分散介质的影响，模拟胃肠蠕动的条件（37℃，50r·min-1的温和搅拌），会更接近制剂进入体内自乳化的真实情况，采用透光率的相对百分率去测定乳化时间，测定结果也会更加准确。LTX-SEDDS自乳化时间的延长，与未加入助乳化剂有着密切的关系，尽管粒径偏大，自乳化时间偏长，但是制剂最终是稳定、均一的自微乳体系[12]。

f.常认为电位绝对值在20～40mV时，体系会稳定，本实验zeta电位测定结果显示，LTX-SEDDS自乳化后的zeta电位为（-24.2±1.22)mV，稳定性实验也证明具有较好的稳定性。

g.SEDDS经口服后，胃肠液不断增多使自微乳在胃肠道中不断被稀释，其中乳化剂的浓度也持续降低，可能会影响微乳界面膜的稳定性，因此有必要考察不同分散介质以及不同稀释倍数对SEDDS稳定性的影响，对研究SEDDS进入体内后能否保持良好的微乳状态具有重要意义。LTX-SEDDS体内自乳化后的稳定性不受稀释介质和稀释体积的影响，因此可以预测LTX-SEDDS在胃肠道中自乳化不受胃肠道体液影响，且在胃肠道被体液大量稀释后，稳定性仍旧良好，使LTX被胃肠道吸收前都以乳剂状态存在，有利于提高LTX的口服生物利用度[13]。

4、结论

作者所制备的拉洛他赛自乳化释药系统，易于制备，得到的自乳化制剂粒径分布均匀，制剂稳定，可显著的提高拉洛他赛的口服生物利用度，为其他口服难溶性的化疗药物生物利用度的提高提供一种新的思路。

参考文献：

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[6]王娇,李葆林,何晓明.新型自乳化给药系统研究进展[J].中国现代应用药学,2016,33(1):119-121.

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