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盐酸依福地平和尼莫地平肠道透过性的比较研究

2020-08-13 416 上传者：管理员

摘要：目的：比较两种难溶性药物盐酸依福地平和尼莫地平的肠道透过率,考察固体分散技术和纳米制剂对药物肠道透过性质的影响,以期为难溶性药物的口服吸收的改善提供依据。方法：采用外翻肠囊法评估药物的表观渗透系数。结果：尼莫地平原料药的表观渗透系数约是盐酸依福地平的6倍;盐酸依福地平与尼莫地平的纳米混悬剂的表观渗透系数与各自原料药相比基本没有改善,盐酸依福地平和尼莫地平固体分散体的表观渗透系数分别是各自原料药的2.76倍和1.86倍。结论：对于这两种地平类药物,相比于制备成纳米混悬剂,制备成固体分散体能更明显的改善药物的肠吸收。

关键词：
外翻肠囊法
尼莫地平
盐酸依福地平
肠吸收
药剂学
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盐酸依福地平和尼莫地平临床上主要用于治疗心脑血管疾病,抗高血压用药[1,2,3,4,5,6,7]。盐酸依福地平是由日产化学和泽利亚新药共同开发,1994年在日本上市,商品名Landel®。该药溶解度低,因此需通过相应的制剂工艺提高药物的溶出速率或表观溶解度,达到改善口服生物利用度。NMP最早由德国拜耳(Bayer)公司研制成功,1985年在德国上市,1987年进入美国市场。在我国已被列入国家基本药物目录。拜耳公司生产尼莫地平片商品名为尼膜同,Nimotop®,采用固体分散体技术,使难溶性尼莫地平水中溶解度大大增加。

两种药物的基本性质和结构见表1和图1。由于两种药物都属于地平类,并且溶解度都较低,口服生物利用度均低于16%,所以要通过制备成不同的剂型来改善其在肠道的吸收,何种剂型或存在状态更有效,一直是难溶性药物探讨的课题。

图1盐酸依福地平(A)和尼莫地平(B)的结构

表1盐酸依福地平和尼莫地平的物理化学性质

影响药物跨膜转运能力的因素很多,如分子量,溶解度,油水分配系数,以及药物的剂型。在口服药物生物利用度的研究中,评估药物的肠吸收性能是至关重要的。用外翻肠囊法(evertedintestinalsacs)[11]评估药物在胃肠道中的吸收;外翻肠囊法是一种简便有效、容易实现的初步研究药物肠渗透性的方法[14,15,16],常用于药物的吸收能力、吸收部位、吸收机制的考察。药物穿透膜的能力是影响药物全身吸收程度的因素之一,并且通过胃肠壁评估药物的渗透性可以帮助理解药物在胃肠道中的吸收。

1、仪器与材料

BS110S电子天平(北京赛多利斯有限公司),ZRS-8L智能溶出试验仪(天津天大天发科技有限公司),LC-10A高效液相输液泵和SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司),AT-130柱温箱(天津鑫洲科技有限公司),N2000色谱数据处理系统(浙江大学智能信息工程研究所),KDC-40低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司),KDC-16H高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司),PM行星式球磨机(南京驰顺科技发展有限公司),DX-2700X-射线粉末衍射仪(丹东浩元仪器有限公司),DSC-1/200热分析仪(瑞士梅特勒-托利多公司)。

盐酸依福地平原料药(日研化学工业制药有限公司,含量质量分数>99%),盐酸依福地平市售制剂(Landel®,日本泽利亚有限公司),尼莫地平原料药(郑州瑞康制药有限公司,含量质量分数>99%),尼莫地平市售制剂(Nimotop®,德国拜耳有限公司),HPMCAS-LF(日本信越有限公司),泊洛沙姆188(德国巴斯夫有限公司),十二烷基硫酸钠(SDS,天津博迪化工有限公司),甲醇和乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司);其余试剂均(分析纯,市售)。

实验动物:Sprague-Dawley大鼠,雄性,体质量为200±20g(沈阳药科大学动物中心提供,动物许可证号:SYPU-IACUC-C2016-3-12-205)。

2、方法与结果

2.1制备工艺

2.1.1固体分散体的制备

将尼莫地平与载体HPMCAS及尿素按照体积比1∶4∶0.5比例放入蒸发皿中,加入适量丙酮与二氯甲烷的混合溶液(体积比1∶1)溶解,水浴上挥干溶剂,置于红外灯下,搅拌使溶剂蒸发完全后,置于真空干燥箱中干燥过夜,将干燥后的固体分散体粉碎并过筛,避光密封保存,备用。

将盐酸依福地平与载体HPMCAS及尿素按照体积比1∶3∶1比例放入蒸发皿中,加入适量丙酮与二氯甲烷的混合溶液(体积比1∶1)溶解,水浴上挥干溶剂,置于红外灯下,搅拌使溶剂蒸发完全后,置于真空干燥箱中干燥过夜,将干燥后的固体分散体粉碎并过筛,避光密封保存,备用。

2.1.2纳米混悬剂的制备

将体积分数为0.4%HPMCAS20mL装入100mL球磨罐中,精密称取盐酸依福地平原料药40mg,均匀加入到球磨罐中,加入直径0.4～0.6mm二氧化锆球磨珠100g。设定参数,运行次数:48次(8h),运行时间:10min,间隔时间:3min,转速:35Hz交替运行。研磨完毕后过筛,得到药物的混悬剂。

将体积分数为0.4%HPMCAS与F68的混合溶液(体积比1∶3)20mL装入100mL球磨罐中,精密称取尼莫地平原料药20mg,均匀加入到球磨罐中,加入直径0.4～0.6mm二氧化锆球磨珠100g。设定参数:运行次数:48次(8h),运行时间:10min,间隔时间:3min,转速:35Hz交替运行。研磨完毕后过筛,得到药物的混悬剂。

2.2溶出度的测定

盐酸依福地平:采用质量分数0.05%Tween80+pH6.5的磷酸盐缓冲液。采用桨法,转速为100r·min-1,温度为(37±0.5)℃,溶出介质体积为100mL。分别在5、10、15、25、35、45和60min取样5mL,弃去初滤液2mL,取续滤液备用,另补加5mL溶出介质,0.22μm滤膜过滤后,用流动相将续滤液做定量稀释后,进样。溶出曲线见图2。

图2盐酸依福地平溶出曲线

尼莫地平:以pH6.5磷酸盐缓冲液(0.3%SDS)900mL为溶出介质,转速为75r·min-1,温度为37℃,分别于5、10、15、20、30、45和60min时间点取样10mL(同时补37℃空白介质10mL),过0.22μm微孔滤膜,取续滤液适量(≥6mL),照UV法(通则0401)测定,在238nm的波长处分别测定吸光度。溶出曲线见图3。

图3尼莫地平溶出曲线

根据溶出曲线我们可以看出两种药物均在30min内达到最大溶出,并且均达到85%以上。而且相比于各自的原料药,两种药物在制备成纳米混悬剂和固体分散体以后,溶出速率相对更快。

2.3纳米混悬剂与固体分散体的表征

2.3.1盐酸依福地平

X-射线衍射分析:采用Cu靶Kα射线,电压30kV,电流30mA,扫描角度5～50°,4°·min-1,对原料药(a),HPMCAS(b)、尿素(c)、固体分散体物理混合物(d)、固体分散体粉末(e)和纳米混悬剂冻干粉(f)结果见图4。

图4盐酸依福地平的X-射线衍射图谱

在X-射线衍射图谱上,原料药有明显的衍射峰,同时在物理混合物中药物依然以晶型存在,而在固体分散体中的图谱中,只出现了尿素的特征峰,说明药物以无定形的形式存在于固体分散体中。在纳米混悬剂冻干粉的图谱中也没有药物的特征峰出现,说明药物依然是以无定形的状态存在于纳米混悬剂中的。

DSC分析:针刺穿孔的坩埚;升温速度10℃·min-1;吹扫气:氮气,20mL·min-1;保护气:氮气,60mL·min-1。在80°到200°范围内对原料药(a),尿素(b)、HPMCAS(c)、固体分散体物理混合物(d)、固体分散体粉末(e),纳米混悬剂冻干粉(f)进行扫描分析。结果见图5。

图5盐酸依福地平的差式扫描量热仪图谱

药物在152.3℃有一个明显的吸热峰,固体分散体的物理混合物在142～154℃有吸热峰存在,说明药物依然以晶型存在于物理混合物中,而在纳米混悬剂冻干粉和固体分散体粉末中未见药物的吸热峰,说明药物以非晶形存在于制剂中。

结合以上表征数据,可以证明药物在固体分散体和纳米混悬剂中均以无定形存在。

2.3.2尼莫地平

X-射线衍射分析:采用Cu靶Kα射线,电压40kV,电流40mA,扫描角度5～40°,6°·min-1,对原料药(a),纳米混悬剂物理混合物(b)、纳米混悬剂冻干粉(c)、固体分散体物理混合物(d)、固体分散体粉末(e),结果见图6。

图6尼莫地平的X-射线衍射图谱

X-射线衍射分析表明,药物和辅料的物理混合物中有原料药的特征衍射峰,表明辅料的存在不会影响药物的结晶形态;在纳米混悬剂的冻干粉的和固体分散体粉末中,未观察到原料药的特征峰。

DSC分析:针刺穿孔的坩埚;升温速度10℃·min-1;吹扫气:氮气,20mL·min-1;保护气:氮气,60mL·min-1。在30°到250°范围内对原料药(a),纳米混悬剂物理混合物(b)、纳米混悬剂冻干粉(c)、固体分散体物理混合物(d)、固体分散体粉末(e)进行扫描分析。结果见图7。

图7尼莫地平的差式扫描量热仪图谱

原料药在125℃有一个明显的吸热特征峰,物理混合物也能明显看到此特征峰。而在纳米混悬剂冻干粉和固体分散体中未观察到如此明显的吸热峰。结合以上可知在纳米冻干粉中和固体分散体中药物以晶型存在。

2.4外翻肠囊实验方法

2.4.1Krebs-Ringer肠营养液(简称K-R营养液)的配制

每1000mL蒸馏水中含有氯化钠7.52g,氯化钾0.35g,氯化钙0.37g,氯化镁0.22g,磷酸二氢钠0.22g,葡萄糖1.4g,碳酸氢钠1.37g,用磷酸/氢氧化钠调至溶液pH7.4。

2.4.2外翻肠囊法实验模型的建立

实验前将大鼠禁食过夜,腹腔注射体积分数20%乌拉坦溶液,剂量为5mL·kg-1。沿腹中线打开腹腔,剥离小肠,选择所需肠段。各肠段区间:十二指肠(duodenum)为幽门下1cm处开始;空肠段(jejunum)为自幽门15cm处开始;回肠段(ileum)为自盲肠上行20cm处开始;结肠段(colon)为紧邻盲肠至直肠,均取6cm左右。分离所需肠段后,立即置于冰冷的(4℃)的K-R营养液中,用K-R营养液冲洗肠段,去除肠系膜和浆膜层外面的脂肪组织。将洗净的肠段放在干净的滤纸上,吸去肠浆膜面的液体。

用玻璃棒小心翻转,使粘膜侧向外,洗净内容物,直至没有污物流出,吸干表面,用细线结扎一端,将小肠上端固定于取样口,用注射器从取样口处向肠内注满空白K-R营养液,记录注入液体体积V0,作为受药体系。然后将其垂直放入含有药物溶液的容器中,37℃恒温并通入混合气体(5%CO2,95%O2)。装置示意图见图8。分别于15、30、45、60和75min吸取受药体系溶液300μL,待测,同时补充等量的K-R试液。

图8外翻肠囊法实验装置图

2.4.3色谱条件

盐酸依福地平:色谱柱为HypersilODSC18(200mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(体积比30∶100);检测波长为254nm;柱温为35℃;流速为1.0mL·min-1;进样量为20μL

尼莫地平:色谱柱为HypersilODSC18(200mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(体积比55∶45);检测波长为238nm;柱温为35℃;流速为1.0mL·min-1;进样量:20μL。

2.4.4离体肠吸收的研究方法

药物累积吸收量计算:

M累积量=(cnV0+0.3∑i=1n−1ci)/A

M累积量:药物各时间的累积吸收量(μg·cm-2);c:实际检测浓度(mg·L-1);V0:肠段的体积(mL);A:肠黏膜的表面积(cm2)

药物的表观渗透系数计算:

Papp=dQ/dtAc0dQ/dt

dQ/dt:药物转运量(μg·s-1);A:肠黏膜的表面积(cm2);c0:供药池中药物的初始浓度(mg·L-1)

2.5盐酸依福地平和尼莫地平原料药在不同肠段的吸收

两种药物的原料药在不同肠段吸收情况的结果见图9和图10通过对比发现药物在空肠和回肠的吸收量较大,容易测得,故以下实验中选用空肠和回肠两个肠段进行研究。结果表明尼莫地平原料药的累积渗透量明显高于盐酸依福地平,推测可能原因是药物的分子量越小,肠道吸收越好;除此之外,尼莫地平为中性,盐酸依福地平为弱酸性,所以在碱性的肠道环境中,盐酸依福地平以离子形式存在,尼莫地平以分子形式存在,更容易透过细胞膜被吸收。

图9盐酸依福地平在不同肠段的平均累计渗透量(n=3)

图10尼莫地平在不同肠段的平均累计渗透量(n=3)

2.6盐酸依福地平和尼莫地平的表观渗透系数

有许多方法可以提高难溶药物的溶解度,包括将药物微粉化,纳米化,或制备成包合物,固体分散体。在本次研究中我们主要考察纳米混悬剂和固体分散体对药物肠道吸收的改善。

2.6.1纳米混悬剂

纳米混悬剂对两种药物吸收的影响结果见表2。盐酸依福地平纳米混悬剂的表观渗透系数与原料药的表观渗透系数相似;尼莫地平的纳米混悬剂的表观渗透系数与原料药相比也基本没有改变。

表2盐酸依福地平和尼莫地平原料药,市售制剂,纳米混悬剂在回肠的表观渗透系数Papp(n=3)

比较两种药物原料药的肠道吸收,在制备成纳米混悬剂后,均低于市售制剂,与原料药相比肠道吸收基本没有改善。推测可能原因是两种药物在制备成纳米混悬剂以后,虽然粒径减小了,但是在液体中的稳定性不好,导致肠道吸收并没有提高。

2.6.2固体分散体

固体分散体对两种药物吸收的影响结果见表3。盐酸依福地平固体分散体的表观渗透系数是其原料药的2.76倍;制备成固体分散体的尼莫地平的表观渗透系数是其原料药的1.86倍。

表3盐酸依福地平和尼莫地平原料药,市售制剂,固体分散体在回肠的表观渗透系数Papp(n=3)

两种制剂的对比结果见图11,当被制备成固体分散体时,虽然依然低于市售制剂,但是在肠道的吸收都有了较明显的提高,此外,盐酸依福地平的固体分散体的表观分布系数是纳米混悬剂的2.25倍;尼莫地平的固体分散体的表观分布系数是纳米混悬剂的1.6倍,而且两种药物已上市的市售制剂都是采用固体分散体的技术来改善药物在体内的吸收,由此可推测制备成固体分散体将会更好的改善地平类药物在肠道的吸收。

图11原料药,盐酸依福地平市售制剂(Ladel®),尼莫地平市售制剂(Nimotop®)和自制固体分散体在回肠的表观渗透系数(n=3)

3、结论

通过对两种难溶性药物的研究,制备成固体分散体和纳米混悬剂都会改善药物的肠道吸收,但是固体分散体对药物吸收的改善更加明显,也就是说对于难溶性的地平类药物制备成固体分散体将会是一个更有效的改善药物肠道吸收的方法。与此同时,外翻肠囊的实验方法是一个既有效又方便的评估药物吸收的方法。

曹辰,郭婷婷,邹梅娟,程刚,朴洪宇.两种地平类药物肠道透过性的比较研究[J].沈阳药科大学学报,2020,37(06):488-493.

基金:沈阳药科大学中青年教师事业发展支持计划资助项目(2015).