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不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解特性的差异研究

2020-08-21 298 上传者：管理员

摘要：目的：探索不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解特性的差异，以及依诺肝素钠精细结构表征，为此类药物的质量控制提供理论依据。方法：考察3种肝素酶Ⅰ在不同条件下对依诺肝素钠的降解特点，并利用离子交换色谱法纯化降解产物，之后进行质谱和核磁共振分析，获得结构信息，从而阐述降解产物组成和降解效率的差异。结果：不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠的降解效果不同。大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ的降解效率要高于来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ，而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ效率最低。经离子交换纯化获得数个寡糖，通过结构确认的1个寡糖组分（ΔUA2S-GlcNS6S-IdoA2SGlcNS6S）在第1和第2种酶的降解产物中没有发现，而在第3种酶的降解产物中始终存在。结论：本文比较了3种不同来源肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠过程中的细微差异，为以肝素酶降解为基础的依诺肝素钠结构研究和质量控制提供了有效支持。

关键词：
临床应用
依诺肝素钠
寡糖
核磁共振
结构解析
肝素酶
裂解酶
高效液相色谱
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肝素是目前应用时间最长的一种复杂生物大分子药物，主要作为抗凝剂广泛应用于临床，但在长期应用中发现肝素较易引起出血和血小板减少导致的急性血栓等并发症，所以在临床使用上受到一定的限制[1,2]。肝素经降解得到的如依诺肝素钠等低分子量肝素，由于具有副作用低及生物利用度高等优势，具有更好的临床应用前景[3]。

肝素及低分子量肝素主要是通过激活抗凝血酶原Ⅲ（antithrombinⅢ，ATⅢ）并通过与凝血瀑布中Ⅹa和Ⅱa因子结合来发挥抗凝作用[4]，因此深入解析肝素类药物的精确结构，对研究其生物活性及其临床新适应症拓展均具有重要意义。由普通肝素经化学降解得到的依诺肝素钠，在非还原端发生4,5位脱水生成不饱和糖醛酸，同时还原端间或产生1,6位脱水氨基葡萄糖，这些特征结构的增加给依诺肝素钠的结构解析工作带来更大的挑战[6]。

依诺肝素钠等低分子量肝素的常见结构分析方法主要有2种：一种是由上而下（top-down）的分析方法，是直接对完整的低分子量肝素寡糖进行分析[7]，由于低分子量肝素的高复杂性，该分析方法存在极大的挑战；另一种是从片段到整体（bottom-up）的分析方法，该方法是将完整的的低分子量肝素糖链经过肝素酶的降解，对完全降解得到的二糖进行分析[8,9,10,11]。

酶解后的产物分析是解析依诺肝素钠这类复杂的不均一多糖结构组成的重要策略，所以酶的降解特性研究就显得至关重要。肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂解酶，它广泛应用在肝素类药物制备、降解、结构解析和质量控制中。肝素酶最初是从肝素黄杆菌中发现和分离得到的，目前已经分离纯化得到3种具有不同底物的选择性肝素酶，不同肝素酶具有不同的作用特点：肝素酶Ⅰ能特异性地切割肝素分子中GlcNS6S(1-4)IdoA2S之间的连接键；肝素酶Ⅲ能特异性切割硫酸乙酰肝素分子中GlcNS/GlcNAc(1-4)GlcA之间的连接键；肝素酶Ⅱ底物选择性最宽，对肝素中的大多数结构的连接位点均有切割作用[12]。

由于肝素酶Ⅰ主要针对肝素分子中常见的重复二糖单元进行降解，而对肝素中与抗凝活性相关的非规则区降解效率较低，所以肝素酶Ⅰ是研究肝素非规则区结构的有力工具。目前除了常见的肝素黄杆菌发酵法生产的肝素酶Ⅰ，市面上还存在利用如大肠杆菌等工程菌株生产的重组肝素酶Ⅰ，还可以以融合蛋白的形式表达肝素酶Ⅰ[13,14]。因此，市面上肝素酶Ⅰ的种类较多且各厂家间的生产工艺也有所不同，而目前有关这些肝素酶Ⅰ对肝素类药物的降解特性差异的研究还非常有限。

肝素黄杆菌原生肝素酶Ⅰ来源于肝素黄杆菌，大肠杆菌表达体系的原生肝素酶来源于大肠杆菌，而大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ是在重组过程中添加了改善其溶解特性的基因表达而来，3种肝素酶Ⅰ的酶促反应底物选择性一致；最适宜条件均为pH7.4，温度20～37℃；稳定性较差，在-20℃下储存可以保存6个月。因此本文选择了这3种不同来源和表达方式的肝素酶Ⅰ，以依诺肝素钠为样品，研究其对依诺肝素钠的降解规律，以及降解产物的差异。

1、仪器、试剂与材料

1.1仪器

安捷伦1290液相色谱仪串联6540四极杆/时间飞行质谱（Agilent公司）；HT7200A制备液相色谱仪（苏州汇通色谱分离纯化有限公司）；ASCENDTM600型核磁共振波谱仪（布鲁克）；PURELABOption-S7/15超纯水机（ELGA公司）。

1.2试剂与材料

依诺肝素钠化学对照品购自Sigma公司；来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ和大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ购于北京艾德豪克公司；大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ由山东大学国家糖工程中心李福川教授提供；高氯酸钠（500g·瓶-1,d≥99%）和磷酸二氢钠（500g·瓶-1,d≥99%）购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸（500mL·瓶-1,d≥85%）购自江苏强盛功能化学股份有限公司；重水（D2O,d≥99.96%）和氘代3-（三甲基硅烷基）丙酸钠（TSP-d4,d≥98%）购自Sigma公司；其他试剂均为色谱纯。

2、方法与结果

2.13种肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠的完全降解产物研究

2.1.1方法

2.1.1.1降解

取依诺肝素钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成1mg·mL-1的溶液；精密量取3份上述溶液各20μL，分别加入足够量的3种肝素酶Ⅰ液（每1mg依诺肝素钠使用25IU的肝素酶Ⅰ），置于37℃恒温水浴箱中降解12h后，于100℃沸水中加热15min终止反应，12000r·min-1离心10min取上清液，0.22μm滤膜过滤，取滤液，即得供试溶液，待用。

2.1.1.2色谱分析

取供试溶液进行色谱分析。色谱条件：采用WelchUltimateXB-SAX色谱柱（4.6mm×250mm,3µm），以2mmol·L-1磷酸二氢钠溶液（pH3.0）为流动相A，含1.2mol·L-1高氯酸钠的2mmol·L-1磷酸二氢钠溶液（pH3.0）为流动相B，洗脱梯度（程序见表1），流速0.6mL·min-1，检测波长232nm，柱温40℃，进样量5µL。

表1梯度洗脱程序

2.1.2结果

已知依诺肝素分子的基本结构大体可以分为2类，一类是由最常见的3位硫酸化的二糖重复单元，即2位硫酸化的艾杜糖醛酸（IdoA2S)1-4连接6,N位硫酸化的氨基葡萄糖（GlcNS6S）组成，形成分子中的规则区，该区域与抗凝血酶Ⅲ亲和力较低；一类是含有不同糖醛酸（IdoAorGlcA）和不同硫酸化程度位置的不规则区，该区域可能含有能与抗凝血酶Ⅲ的特异性结合的特殊五糖序列GlcNAc/NS6S(1-4)GlcA(1-4)GlcNS3S,6S(1-4)IdoA2S(1-4)GlcNS6S，往往与ATⅢ有较高亲和力。肝素酶Ⅰ主要针对肝素分子中常见的重复二糖单元进行降解，而对肝素中与抗凝活性相关的非规则区降解效率较低。因此，降解产物中会产生常见的二糖以及不能被彻底降解的寡糖组分。

由图1可见，在加入足够量酶的情况下，3种肝素酶Ⅰ的降解产物在二糖组成上并无明显区别，而在寡糖组成上存在差异。来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ以及大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ降解得到的依诺肝素钠寡糖组成无明显差异，而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠所得降解产物中存在1个特有的寡糖，已在图1中用*标记出，其在色谱中的保留时间为35min。

图13种肝素酶Ⅰ充分降解依诺肝素钠所得寡糖图谱

2.2未被肝素酶Ⅰ彻底降解依诺肝素寡糖的结构解析

2.2.1方法

2.2.1.1特殊寡糖样品的制备与纯化

取依诺肝素钠对照品适量，加水溶解并稀释成20mg·mL-1的溶液，然后加入足够量的肝素酶Ⅰ液（每1mg依诺肝素钠使用25IU的肝素酶Ⅰ），并在37℃放置12h，即得酶解液。酶解液沸水浴加热15min终止反应后在12000r·min-1下离心15min，取上清液，即得依诺肝素钠降解产物溶液。降解产物中的特殊寡糖经HT7200A制备型高效液相色谱仪，运用强阴离子交换色谱按表1梯度洗脱分离得到样品溶液，利用葡聚糖凝胶色谱（SephadexG10）除盐、经旋转蒸发设备浓缩、经冷冻干燥仪冻干，即得特殊寡糖样品。

2.2.1.2质谱分析

取特殊寡糖样品10mg溶解于2mL纯水中，作为供试溶液，按照确定的质谱条件进行分析，通过高分辨质谱确认准确相对分子质量。质谱条件：ESI离子模式为负离子模式，雾化气压4.35kPa，干燥气流速8L·min-1，干燥温度350℃，毛细管电压3.5kV，碎片电压150V，全扫描模式，扫描范围m/z100～3000。

2.2.1.3核磁共振结构解析

取特殊寡糖样品29.5mg溶于600μLD2O（含50μg·mL-1TSP-d4）中，作为供试溶液，展开核磁共振结构研究。核磁共振条件：1HNMR、COSY及HSQC谱扫描次数均为16,13CNMR谱扫描次数为10240。试验温度均为298.2K。数据处理过程中各峰的化学位移均以内标TSP的化学位移作为0进行校准。

2.2.2结果

该寡糖结构对于解析依诺肝素钠结构，以及认识肝素酶的作用位点具有重要意义。因此本文对该寡糖纯化后，利用高分辨质谱和核磁共振进行结构确认。

图2显示该寡糖的离子峰为[M1-2H]2-:575.9682，通过计算得知其准确相对分子质量为1153.9521。另外2个带2个负电荷的质谱峰（m/z416.0517和m/z496.0094）分别对应其源内裂解丢失4个和2个硫酸根后的物质，597.9481为其加钠峰。依诺肝素钠常见单糖组成L-艾杜糖醛酸IdoA,D-葡萄糖醛酸GlcA和α-D-葡萄糖胺GlcN的相对分子质量分别为194.0427、-194.0427、179.0794。根据相对分子质量推断该寡糖为依诺肝素四糖，寡糖结构中还含有6个硫酸根，但是其具体的硫酸化位点需要借助核磁共振谱进一步确证。

图2依诺肝素钠经大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ酶解后寡糖质谱结果

根据1H-1H-COSY和1H-13C-HSQC的分析，所有的氢信号和碳信号在图3中一一归属。硫酸根的数量及其取代位置的差异使依诺肝素钠的核磁信号具有一定特征。结合相关文献，对该依诺肝素钠四糖的核磁信号进行归属[15]。非还原端的HⅠ4的化学位移为5.99,CⅠ4的化学位移为108.92。4个糖单元特征性的1位氢信号（HⅠ1,HⅡ1,HⅢ1,HⅣ1）分别为5.51、5.43、5.21和5.45,1位的碳信号（CⅠ1,CⅡ1,CⅢ1,CⅣ1）分别为100.11、99.70、102.40和93.74。图3中归属所得的所有碳信号和氢信号均可推断出该四糖的结构为ΔUA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S（图4）。

2.33种肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠的效率差异

2.3.1方法

2.3.1.1降解

取依诺肝素钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成1mg·mL-1的溶液；精密量取3份上述溶液各60μL，分别加入适量的3种肝素酶Ⅰ混合液（即每1mg依诺肝素钠使用10IU的肝素酶Ⅰ），置于37℃恒温水浴箱中降解，分别于2、4、12h取样20μL，于100℃沸水中加热15min终止反应，12000r·min-1离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤，取滤液，即得供试溶液，待用。

图3依诺肝素钠经大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ酶解后寡糖1H-1H-COSY(A）和1H-13C-HSQC(B）核磁共振图谱

图4依诺肝素钠经大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ酶解后寡糖结构图

2.3.1.2色谱分析

取供试溶液进行色谱分析。色谱条件同“2.1.1.2”项。

2.3.2结果

根据实验结果，可见3种肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠所得的产物组分存在明显差异。因此通过降低3种肝素酶Ⅰ的用量，以及监测不同时间段的酶解情况，来对比3种肝素酶Ⅰ在降解过程中的动态变化差异。

由图5和图6可见，随着降解时间的延长，降解产物中二糖组成上升，寡糖组成降低，而3种不同的肝素酶Ⅰ在降解依诺肝素钠以及对“2.2”项中进行结构解析的特征寡糖时降解效率存在一定差异，尤其是特征寡糖的组成变化差异明显。来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ以及大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ降解效果相似，随着酶解时间降解程度提高，均能在足够用量的情况下将依诺肝素钠四糖降解为二糖，但大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ的降解效率更高。而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ降解效率较低，且在足够用量的情况下仍不能彻底将依诺肝素钠四糖彻底降解为二糖，且随着酶解时间变化，降解结果差异不大。

图53种不同肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠效率对比

图63种不同肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠四糖效率对比

3、结论

本研究通过对比3种肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠的降解作用，可知3种肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠的降解效果存在一定差异。在足够用量的前提下，来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ以及大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ降解产生的二糖及寡糖组成没有明显差异，而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ降解产生了1个寡糖组分，这个是另外2种肝素酶Ⅰ降解产物中所没有的，经过质谱和核磁共振等结构解析可知其结构为ΔUA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S。同时，当肝素酶Ⅰ用量减少，通过监测不同时间点的依诺肝素钠降解程度，可知来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ以及大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ降解效果相似，且大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ降解效率更高；而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ降解效率较低，且随着时间变化，降解程度变化不大。

总体而言，肝素酶Ⅰ在依诺肝素钠的结构解析和质量控制中都起到了重要作用，所以肝素酶Ⅰ的选择十分重要，采用不同来源的肝素酶Ⅰ可能产生不同的结果，对实验结论的得出带来一定影响。因此，本研究结果对依诺肝素钠的质量控制和结构研究中肝素酶的选择和使用也具有一定的借鉴意义。

朱梦,李笃信,杨凯歌,李富川,张真庆.不同来源肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解作用的研究[J].药物分析杂志,2020,40(07):1254-1261.