三匹风又名蛇莓(Duchesnea indica (Andr.) Focke),为蔷薇科蛇莓属的多年生草本植物[1]。生于山坡、道边及杂草间,在辽宁以南的全国各省区均有分布[2],民间主要用于治疗痢疾、肠炎、水火烫伤、蛇咬伤、疔疮肿毒[3]。现代研究表明该属植物含有丰富的黄酮、三萜、酚酸及酚酸脂、其他类等化学成分[4]及显著的抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、抗单纯疱疹病毒[7]等药理活性。课题组前期在苗族地区调研发现鲜药三匹风在苗族民间治疗蛇尿疮有显著的效果,为了深入研究该属植物的抗单纯疱疹病毒的活性成分,课题组对三匹风化学成分进行了分离研究。

1、仪器与材料

1.1仪器

Bruker AVANCE NEO-400Mhz (德国布鲁克公司);ZF-7A型紫外光谱仪(上海勤科分析仪器有限公司);W-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);SHZ-DIII型多用真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);SK8200LHC超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2材料

层析硅胶:(200～300目、300～400目)青岛海洋化工有限公司;硅胶薄层层析板:(GF254)青岛海洋化工有限公司;聚酰胺:(100～200目)国药集团化学试剂有限公司;聚酰胺薄膜:(薄层层析板)国药集团化学试剂有限公司;显色剂:10%硫酸乙醇试剂;其他试剂均为国产分析纯。

实验药材2019年5月采于贵州省贵阳市,由贵州中医药大学刘晓龙老师鉴定为蛇莓(Duchesnea indica (Andr.) Focke)。

2、提取分离

自然干燥的蛇莓药材(5 kg)粉碎后用75%甲醇渗漉提取一周,提取液减压回收溶剂,浓缩后得总提物500 g。总提取物分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分为三部分,石油醚部分55.4 g、乙酸乙酯部分109.4 g、正丁醇部分211.5 g。石油醚部分进行硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯(10∶1-5∶1-2∶1)梯度洗脱,薄层层析检测,分为SA和SB两部分,SB部分通过反复硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯5∶1)得化合物1 (67 mg)和化合物2 (71 mg)。乙酸乙酯部分进行聚酰胺柱层析,乙醇(30%、50%、70%)梯度洗脱,聚酰胺薄层检测,分为YA、YB、YC三部分,YA部分经过聚酰胺层析,乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸-水(30∶5∶1∶1)等梯度洗脱,聚酰胺薄层检测,分为YA1、YA2、YA3三个部分。YA1部分反复硅胶柱层析(二氯甲烷醇8∶1)得到化合物3 (13 mg)、4 (20 mg)。YB部分通过反复硅胶柱层析(二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-8∶3∶1,石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-5∶1∶1∶1)得到化合物5 ( 10 mg)、6 (21 mg)、7 (17 mg)。

3、结构鉴定(图1)

化合物1透明油状物。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ5.58-5.11 (m,6H-9,10,12,13,15,16),2.79 (dd,J=8.1,7.1 Hz,H-11,14),2.33 (t,J=7.5 Hz,2H,H-2),1.68-1.58 (m,2H,H-3),1.34-1.24 (m,8H,H-4,5,6,7),0.95-0.85 (m,3H,H-18)。13C-NMR (100MHz,Chloroform-d)δ130.73(C-16),129.02(C-9),127.09(C-12),127.05(C-13),126.60(C-15),125.96(C-10),32.97(C-2),28.41(C-5),28.00(C-6),27.92(C-7),27.88(C-8),26.03(C-14),24.46(C-11),24.37(C-3),23.50(C-17),19.39(C-4),13.09(C-18)。以上数据与文献[8]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物1为linolenic acid。

化合物2透明油状物。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ5.39 (tq,J=6.9,1.4 Hz,H,H-2),4.14 (d,J=6.9 Hz,2H,H-1),2.01-1.95 (m,2H,H-4),1.65 (s,3H,H-20),1.61-1.17 (m,19H),0.88-0.82 (m,12H,brs)。13C-NMR (100 MHz,Chloroform-d)δ140.20(C-3),123.09(C-2),59.35(C-1),39.88(C-4),39.38(C-14),37.44(C-8),37.37(C-10),37.29(C-12),36.68(C-6),32.79(C-7),32.70(C-11),27.98(C-15),25.15(C-5),24.80(C-13),24.48(C-9),22.72(C-17),22.63(C-16),19.75(C-18),19.72(C-19),16.16(C-20)。以上数据与文献[9]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物2为trans-phytol。

化合物3白色针晶。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ5.88 (s,H,H-4),5.78 (s,H,H-8),4.38 (p,J=6.8,6.1 Hz,H,H-9),2.43 (dd,J=17.0,3.7 Hz,H,H-2a),2.21 (d,J=17.0 Hz,H,H-2b),1.88 (s,3H,H-11),1.30-1.23 (m,3H,H-10),1.06 (s,3H,H-12)。13C-NMR (100 MHz,Chloroform-d)δ198.41(C-1),163.39(C-3),135.69(C-2’),129.03(C-1’),126.78(C-2),79.03(C-4),68.02(C-3’),49.68(C-6),41.20(C-5),24.04(C-4’),23.70(C-5,Meβ),22.9(C-5,Meɑ)2,19.04(C-3)。以上数据与文献[10]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物3为Vomifoliol。

化合物4无色晶体。11H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ3.60 (d,J=5.7 Hz,H,H-6),3.53 (d,J=4.0 Hz,H,H-3),2.93 (t,J=2.9 Hz,H,H-8),1.87 (p,J=1.9 Hz,H,H-5eq),1.51 (dd,J=7.0,2.8 Hz,H,H-2eq),0.93 (t,J=3.5 Hz,H,H-1),0.89 (q,J=2.8,2.2 Hz,H,H-4),0.83–0.80 (m,H,H-2ax),0.74 (dt,J=5.9,2.8 Hz,H,H-5ax),0.67 (d,J=1.3 Hz,H,H-7),0.40 (d,J=2.4 Hz,H,H-9),0.36 (d,J=2.5 Hz,H,H-10)。13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ69.84(C-3),67.86(C-6),42.11(C-1),38.23(C-2),35.03(C-4),30.86(C-5),24.77(C-8),20.96(C-7),18.43(C-9),16.08(C-10)。以上数据与文献[11]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物4为(+)-(6s)-Hydroxymenthol。

化合物5白色粉末。1H-NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ5.31-5.29 (m,1H,H-12),3.94 (ddd,J=12.0,4.4,2.8 Hz,H,H-2β),3.33 (d,J=2.8 Hz,H,H-3β),1.36 (s,3H,H-27),1.29 (s,3H,H-29),1.20 (s,3H,H-23),0.94 (d,J=6.7 Hz,3H,H-26),0.88 (s,3H,H-30),0.79 (s,3H,H-25)。13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4) δ 180.93(C-28),138.67(C-13),127.96(C-12),78.71(C-3),72.19(C-19),65.89(C-2),53.68(C-18),48.03(C-5),47.18(C-9),46.80(C-17),41.69(C-14),41.33(C-1),41.08(C-20),39.85(C-8),38.07(C-4),37.97(C-10),37.62(C-22),32.70(C-7),29.43(C-23),28.24(C-15),25.81(C-29),25.58(C-21),25.20(C-16),23.53(C-27),23.31(C-11),21.05(C-24),17.88(C-6),16.14(C-26),15.49(C-30),15.22(C-25)。以上数据与文献[12]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物5为euscaphic acid。

化合物6白色粉末。1H-NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ5.26 (t,J=3.7 Hz,1H,H-12),3.50 (dd,J=9.9,5.9 Hz,1H,H-3a),2.85 (s,1H,H-18),1.53 (S,3H,Me-29),1.30(S,3H,Me-24),1.28-1.22(m,6H,Me-26,Me-30),1.10(S,6H,Me-23,Me-25)。13C-NMR (100 MHz,Methanol-d4)δ181.11(C-28),138.37(C-13),128.82(C-12),78.76(C-3),72.94(C-19),55.34(C-5),53.50(C-18),49.43(C-9),47.71(C-17),41.43(C-14),41.30(C-20),39.91(C-8),38.74(C-1),38.63(C-4),37.70(C-22),36.98(C-10),32.93(C-7),28.33(C-23),27.92(C-15),26.71(C-2),26.08(C-21),25.52(C-16),24.18(C-27),23.66(C-11),18.49(C-6),16.50(C-26),15.90(C-30),15.49(C-25),15.12(C-24)。以上数据与文献[13]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物6为pomolic acid。

化合物7白色片状晶体。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ5.34 (t,J=3.7 Hz,H,H-12),4.50 (d,J=1.6 Hz,H,H-3),2.54-2.52 (m,H,H-18),2.05 (s,3H,CH3CO),1.21 (s,3H,H-27)。13C-NMR (100 MHz,Chloroform-d)δ184.03(C-28),171.10(C-OCOCH3),137.92(C-13),129.26(C-12),80.98(C-3),73.09(C-19), 55.18(C-5),52.80(C-18),47.73(C-17),47.09(C-9),41.07(C-14),41.03(C-20),39.95(C-8),38.05(C-1),37.67(C-4),37.54(C-22),36.92(C-10),32.57(C-7),28.18(C-15),28.03(C-23),27.42(C-29),25.97(C-21),25.32(C-16),24.48(C-27),23.65(C-2),23.51(C-11),21.31(C-OCOCH3),18.38(C-6),17.00(C-26),16.67(C-24),16.16(C-25),15.32(C-30)。以上数据与文献[14]报道的NMR数据基本一致,故鉴定化合物7为19α-hydroxy-3-acetyl ursolic acid。

4、讨论

三匹风贵州省资源丰富,苗族民间使用广泛,具有较好的开发前景,化学成分较多,目前已经分到一百多个化合物。苗族民间用来治疗蛇尿疮有显著疗效,本实验对苗药三匹风进行快速分离,分离出含量较多的单体化合物,并进行抗单纯疱疹病毒活性筛选。目前分离鉴定出五个萜类、一个脂肪酸、一个脂肪醇,分别是linolenic acid(1)、trans-phytol(2)、Vomifoliol(3)、(+)-(6s)-Hydroxymenthol(4)、euscaphic acid(5)、pomolic acid(6)、19α-hydroxy-3-acetyl ursolic acid(7),化学结构见图1。其中化合物3有良好的肿瘤增殖抑制作用[9],化合物5具有一定的促凝血活性[15]、较弱的抗炎活性[16],坡模酸具有很弱的抗炎活性[16],植醇是合成维生素E、维生素K1的原料[17]。

苗族人民在长期的发展中形成自己独特的诊疗体系,深入挖掘民间广泛使用的苗药有利于实现民族产业化,增加社会效益,符合我国大力发展中药民族药的政策,但是药效物质基础不明制约了苗药三匹风向深层次的发展。有文献报道蛇莓乙醇总提取物体外抗单纯疱疹病毒效果最好[7],更具有研究价值,通过本课题研究,期望得到抗单纯疱疹病毒效果好的单体化合物,为该植物的进一步开发、为本地区的民族药产业提供理论依据。

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