2021年世界卫生组织（WHO）报告显示，全球约有2.8亿例抑郁症病人，每年有超过70万人因自杀而死亡，自杀是15～29岁人群的第四大死亡原因[1]。预计到2030年，抑郁症在全球疾病总负担中将升至第1位[2]，抑郁障碍已成为重要的公共卫生问题[3]。目前，抑郁症治疗成功率约为50%,20%～30%的抑郁症病人需要长期或终身治疗[4]，急需寻求预防和治疗疾病的新方式。关于抑郁症炎症病因假说研究已逐渐成为抑郁症发病机制的研究热点[5],NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）炎症小体被认为是潜在的抑郁症炎性标志物之一[6]。已有研究表明，富氢水可以有效抑制海马和前额叶皮层NLRP3炎性小体激活，减少白细胞介素-1β(IL-1β）和活性氧（ROS）的生成，改善慢性不可预测轻度应激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）诱导的抑郁样行为[7]。许多学者认为，氢之所以能在医学领域发挥作用是基于其选择性抗氧化清除细胞毒性自由基的特性[8-9]，氢自由基水是利用氢自由基溶解技术将氢自由基稳定地溶解在水中以提高水的健康价值的新型氢健康饮品。适量的氢自由基可以与其他自由基或大分子物质发生反应，起到清除毒性自由基、维护细胞内稳态的作用。目前，有关氢自由基水的研究有限，其毒理安全性基础实验——急性经口毒性实验[9-11]结果及健康益处尚不完全明确，使临床抑郁症饮食护理健康食品的选择与应用受到限制。研究氢自由基水的安全性及其对抑郁症的保护作用对减轻抑郁症的公共卫生负担，制订预防和改善抑郁症的饮食护理策略具有重要意义。

1、材料与方法

1.1实验对象

1）氢自由基水的急性经口毒性实验：SpragueDawley(SD）大鼠20只，无特定病原体（SPF）级，6周龄，雌雄各半。2）氢自由基水对CUMS诱导的抑郁样大鼠的干预效果研究：32只雄性SD大鼠，SPF级，4周龄。受试大鼠均由山西医科大学动物实验中心提供，本研究涉及的动物实验已通过山西医科大学实验动物福利伦理审查（批准编号为：SYDL2023037）。

1.2实验样品

2种氢自由基水的定型产品，即低浓度氢自由基水（low concentration of hydrogen free radicals in water,FL）和高浓度氢自由基水（high concentration of hydrogen free radicals in water,FH），其氢自由基分别为9.61μmol/L和30.1μmol/L，均为透明色液体，无味，桶装，生产商为恭养堂医疗科技（上海）有限公司。

1.3主要仪器与设备

灌胃针、电子天平、蒸馏水、乌拉坦麻醉剂、实验室常见解剖器械、显微镜、离心机、移液枪、全自动生化分析仪、摊片机、烘片机、全自动包埋机。

1.4实验方法

1.4.1氢自由基水的急性经口毒性实验

选择6周龄SPF级SD大鼠20只，雌雄各半，适应性喂养7 d后基于体重随机分为实验组和对照组，每组雌雄各5只。正式实验前大鼠需禁食不禁水16 h，实验开始后实验组使用高浓度氢自由基水以20 m L/kg灌胃3次，间隔6 h；对照组使用等量蒸馏水以20 m L/kg灌胃3次，间隔6 h。间隔期间实验组自由饮用氢自由基水，对照组自由饮用蒸馏水，实验时间为14 d。

1.4.2氢自由基水对CUMS诱导的抑郁样大鼠的干预效果研究

选择4周龄SPF级雄性SD大鼠32只，适应性喂养7 d后基于体重随机分为正常对照组、模型组、低浓度组、高浓度组，每组8只，每日固定时间灌胃1次，灌胃体积均为20 m L/kg，正常对照组与模型组以蒸馏水灌胃，低浓度组以低浓度氢自由基水灌胃，高浓度组以高浓度氢自由基水灌胃。正常对照组大鼠每笼2只或3只维持正常的群居饲养，其余组均单笼饲养。对模型组、高浓度组、低浓度组大鼠进行CUMS干预[7,12-13],主要包括小笼孤养、24 h昼夜颠倒、4 h噪声、潮湿垫料、禁食不禁水、拥挤、空垫料、异物、夜间射灯、震荡、45°倾斜笼子、小管内限制运动等项目，每日随机选择其中1种或2种干预项目，时间和规律不可预测，造模时间为6周。

1.5观察指标

1.5.1氢自由基水的急性经口毒性实验

1）灌胃后连续观察14 d，观察内容包括大鼠行为活动、是否出现中毒及死亡现象等。2）于大鼠灌胃后1、2、3、7、14 d称重。3）实验结束后将大鼠进行大体解剖，肉眼观察大鼠主要脏器病理变化，称量各脏器重量（g），计算脏器指数（脏器指数=脏器重量/体重×100%）。

1.5.2氢自由基水对CUMS诱导的抑郁样大鼠的干预效果研究

1）实验结束后进行行为学实验，包括糖水偏好实验[14]、旷场实验[12]、强迫游泳实验[14]，通过电脑监测系统进行记录。2）试验结束后采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行血清皮质酮检验，按照试剂盒操作步骤进行操作。3）试验结束后将大鼠麻醉，经下腔静脉取血进行血常规指标（红细胞计数、血红蛋白、红细胞分布宽度变异系数、红细胞分布宽度标准差、白细胞计数、淋巴细胞绝对值）、生化指标（γ-谷氨酰氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素、肌酐、天门冬氨酸氨基转移酶、血清白蛋白、丙氨酸氨基转移酶）测定。4）大鼠死亡后对大鼠进行大体解剖并行苏木精-伊红（HE）染色组织切片，置于光学显微镜下进行组织病理学观察，通过与正常对照组及模型组比较以初步判断服用氢自由基水的短期安全性[15]。

1.6统计学方法

采用SPSS 28.0软件进行统计分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析后再进行最小显著差异法（LSD）检验；不符合正态分布的定量资料以中位数（四分位间距）[M(IQR）]表示，组间比较采用秩和检验；定性资料以频数表示，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1氢自由基水的急性经口毒性实验结果

2.1.1大鼠一般情况

连续观察14 d，其间实验组与对照组大鼠生长情况良好，大鼠饮食、二便、一般活动、常规状态（如呼吸、眼、鼻、口腔、皮肤、被毛等）等均未见异常，无死亡情况出现。

2.1.2大鼠体重变化（见表1)

表1 两组大鼠体重增长率比较

2.1.3各脏器病理学状况

人道处死所有受试大鼠，大体解剖其主要脏器进行肉眼观察，均未见异常。对大鼠的主要脏器称重计算脏器指数，结果显示，实验组与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.2氢自由基水对CUMS诱导的抑郁样大鼠的干预效果

2.2.1 4组大鼠抑郁样行为及血清皮质酮水平比较（见表3)

2.2.2 4组大鼠血常规指标比较（见表4)

2.2.3 4组大鼠生化指标比较（见表5)

表2 两组大鼠脏器指数比较

表3 4组大鼠抑郁样行为及血清皮质酮水平比较

表4 4组大鼠血常规指标比较

表5 4组大鼠生化指标比较

2.2.4病理学变化

与正常对照组相比，高浓度组的心、肝、脾、输精管均未见异常；肾脏切片显示：高浓度组与模型组肾组织肾小球结构基本正常，肾小管上皮细胞均有不同程度的变性坏死，且模型组比高浓度组病变严重；模型组膀胱黏膜下层局部可见轻微炎症细胞浸润，高浓度组膀胱组织整体结构正常，黏膜下层未见明显炎症细胞浸润。

3、讨论

3.1氢自由基水的安全性检测

氢自由基水是利用氢自由基溶解技术将氢自由基稳定地溶解在水中以提高水的健康价值的新型氢健康饮品。目前，有关氢自由基水的研究有限。食用安全性是功效研究的前提，急性经口毒性实验是毒理安全性研究中最基础的一项实验[9-10]，故本研究在探讨氢自由基水抗抑郁效果之前，遵循动物实验伦理3R原则，参考食品安全国家标准28 d经口毒性试验[15]，实施了氢自由基水的急性经口毒性实验，通过对大鼠血常规指标、血生化指标及病理学检查等方面的观察，初步探讨了饮用氢自由基水的短期安全性，结果发现：1）在14 d的观察期内，各组大鼠生长情况良好，日常活动未见异常，皮毛光洁，自主活动与行为表现正常，同性别各组间进食饮水量差异不明显，各器官与系统未见异常，无死亡情况出现。表明氢自由基水并未对大鼠一般情况产生明显的毒性效应。2）体重是评价生长发育期受试动物健康状况最敏感的指标之一[11]。观察期间，同性别实验组大鼠的体重增长率与同期对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，表明实验组大鼠体重受到受试物的影响不明显，氢自由基水未对大鼠的体重产生明显的不良影响。3）脏器指数可以灵敏地反映受试物对受试对象脏器的综合影响[11]。实验结束后，肉眼观察大鼠主要脏器无异常变化，各脏器形态、颜色、质地均正常。同性别实验组大鼠主要器官的脏器指数与对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，表明氢自由基水对大鼠各主要脏器无明显损害。4）大鼠血液学各组指标均在正常生理范围内，表明短期饮用氢自由基水对大鼠的血常规无明显影响。5）低浓度组、高浓度组肾脏功能指标与正常对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，说明氢自由基水对肾脏功能影响较小。6）低浓度组丙氨酸氨基转移酶低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但其在正常生理范围内[16]，故无实际意义。低浓度组、高浓度组碱性磷酸酶水平与正常对照组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)；正常对照组碱性磷酸酶水平与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示可能是由于慢性应激造模致使碱性磷酸酶出现差异，与氢自由基水的“毒性作用”关系不大。

3.2氢自由基水对大鼠抑郁样行为及皮质酮的影响

压力在抑郁症的发生、发展过程中扮演着重要角色[17-20]。抑郁症动物实验研究造模方式较多，CUMS是其最经典、使用最广泛的一种造模方式[21-22]。糖水偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验等行为测试常被用以评价抗抑郁药的疗效[23]。本研究结果显示，慢性应激刺激6周后，模型组与正常对照组相比表现出了蜷缩少动、易受惊、毛发粗糙无光泽，行为学实验结果表现为模型组糖水消耗量减少，旷场实验水平运动降低，强迫游泳静止时间占比增加，提示模型组快感缺乏，对新环境的探索减少，慢性应激降低了大鼠对周围环境的好奇程度，运动活动能力下降，出现绝望情绪，表明抑郁模型建立成功。低浓度组、高浓度组均能提高大鼠糖水消耗量，增加强迫游泳时间，高浓度组能增加水平运动距离，可能是由于氢自由基水逆转了以上行为。已有研究表明，富氢水可以增加抑郁小鼠的糖水摄入量，缩短强迫游泳不动时间[7]，增加抑郁样小鼠的旷场活动总距离和平均速度[24]，与本研究结果相似。Hu等[25]研究结果表明，富氢水可以抑制体内应激相关的IL-1β，使氧化应激水平升高，还可通过抗炎及抗氧化特性有效控制应激反应。Masuda等[26]研究发现，富含氢、矿物质的天然还原水可减少焦虑相关行为，防止氧化应激水平升高。下丘脑-垂体-肾上腺轴是机体的一种自我保护机制，强烈的慢性应激、工作压力、离婚、失业和贫穷等均可导致下丘脑-垂体-肾上腺轴负反馈功能失调，皮质酮释放增多[12]。抑郁症病人皮质酮水平升高，可随着抑郁症状的缓解而恢复[27]。本研究结果显示，模型组大鼠较正常对照组大鼠的皮质酮浓度升高，与已有研究结果[6,12]相似，而低浓度组、高浓度组均能不同程度逆转这一情况，与Hu等[25]研究结果相似。表明氢自由基水可以在一定程度上缓解CUMS诱导的抑郁样行为，且高浓度可能效果更佳。

4、小结

在本实验条件下，实验结果未显示出氢自由基水有急性和短期毒性效应和毒作用特征，并发现其对CUMS诱导的抑郁样行为有一定的保护作用，可能具有剂量效应，后期可继续进行其他安全性实验并探讨其抗抑郁相关分子机制。

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基金资助:山西白求恩医院院级护理科研基金项目,编号:2023YH29;山西医科大学校内横向课题,编号:2F022023040;

文章来源:李晓乐,韩世范,程俊香,等.氢自由基水对慢性应激诱导的抑郁样行为的改善作用研究[J].护理研究,2024,38(22):4013-4018.