我国居民中抑郁症的发病率呈现逐年升高的趋势[1],该病尚无特效药物[2]。研究显示海马区炎症应激的放大,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)在海马区的集聚导致脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达不足,色氨酸羟化酶2 (tryptophan hydroxylase 2,TPH2)和单胺氧化酶A (monoamine oxidase A,MAO-A)的表达下调,致使海马区神经递质如5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、多巴胺(dopamine,DA)的释放不足,以致抑郁症恶性进展[3]。而DJ-1是一种与神经系统疾病相关的蛋白,其表达的异常与神经相关疾病进展关系密切[4]。Weng等[5]研究显示在帕金森小鼠模型中,升高DJ-1的表达能明显抑制髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的表达,减轻动物脑组织海马区的病理损伤。卢宇佳等[6]研究显示在慢性束缚应激致使大鼠抑郁模型中,激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B (serine-threonine kinase,AKT)的表达,升高磷酸化PI3K (phosphorylated PI3K,p-PI3K)以及磷酸化AKT (phosphorylated AKT,p-AKT)的表达能明显减轻海马区的病理损伤。本研究通过慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)复制大鼠抑郁症模型,探讨DJ-1的表达对抑郁大鼠海马区神经递质的影响。

1、材料和方法

1.1实验材料

实验动物:SD大鼠,SPF级,7～8周龄,体质量220～250 g,在SPF级基础动物房中,设定温度(25±2)℃,湿度(45±5)%,12 h/12 h交替光暗循环周期,饮水与摄食自由,基础饲料,进行适应性喂养。

实验试剂:PI3K抑制剂LY294002 (美国Sigma公司),过表达DJ-1蛋白的pc DNA3.1-DJ-1(pc)以及其阴性对照pc DNA3.1-DJ-1-NC (NC)均由正序(上海)生物科技有限公司设计完成。多聚甲醛、麻醉剂(北京索莱宝生物科技有限公司),兔抗大鼠DJ-1、PI3K、AKT、p-PI3K、pAKT、B淋巴细胞瘤-2 (B cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(上海碧云天生物科技有限公司),Trizol试剂盒、抽提试剂盒、Prime Scrip TM试剂盒(大连Ta Ka Ra公司),脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法试剂盒(terminal-deoxynucleoitidyl transferase-mediated nick end labeling,TUNEL)、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒(上海卧宏生物科技有限公司),蛋白质印迹试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司),酶联免疫吸附试剂盒(南京建成生物技术有限公司)。

仪器:T100型实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)扩增仪(美国Bio-Rad公司),CM1950冰冻切片机(德国Leica公司),Tundra冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM)(荷兰赛默飞世尔科技有限公司),REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid显微镜(美国Discover ECHO公司),ZF-288全自动凝胶成像系统(上海嘉鹏科技有限公司)

1.2抑郁大鼠模型的建立以及分组处理

1.2.1抑郁大鼠的造模术

参照Yang等[7]介绍的方法,建立大鼠抑郁模型,具体步骤为:大鼠接受不同的应激刺激,包括4℃冰水游泳5 min;禁食24 h;禁水24 h;距尾根1 cm处夹尾3 min;倾斜45°持续12 h;束缚应激2 h;空笼刺激12 h;潮湿垫料12 h;闪光刺激2 h;1次/s摇晃5 min;噪音刺激10 min;昼夜颠倒24 h;45℃热烘5 min;为了避免小鼠对能够预料刺激的发生而产生适应,每日随机给予小鼠2种刺激因素,相邻2 d内不采用相同的刺激,持续7周。

1.2.2各组大鼠的分组处理[8]

实验动物分为正常对照组(Normal)、模型组(Model)、抑制剂组(LY294002)、过表达组(pc)、过表达+抑制剂组(pc+LY294002),每组10只。其中,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠按上述造模术进行造模,而Normal组大鼠造模过程始终正常喂养,不给予刺激干预;造模成功2 h后,LY294002组大鼠给与侧脑室注射的10 mg/kg的LY294002,同时侧脑室注射2μg/kg的pc DNA3.1-DJ-1-NC;pc组大鼠给与侧脑室注射2μg/kg的pc DNA 3.1-DJ-1;pc+LY294002组大鼠给与侧脑室注射10 mg/kg的LY294002,同时侧脑室注射2μg/kg的pc DNA 3.1-DJ-1;Normal和Model组大鼠给与侧脑室注射10 mg/kg的二甲亚砜,同时侧脑室注射2μg/kg的pc DNA 3.1-DJ-1-NC,定时注射2次,连续处理4周;在给药干预期间大鼠自由饮食,单笼饲养。

1.3各组大鼠神经行为学评估(糖水偏好实验)

糖水偏好指数可用于评估实验动物的快感的缺失与否;测试预处理时,先给与大鼠1%蔗糖水适应12 h后,将动物禁食禁水12 h后,在每只大鼠的笼子里放置蒸馏水和1%蔗糖水2个水瓶,每个水瓶为200 m L,30 min后交换2瓶水的位置,1 h后天平称量水瓶的质量,通过[蔗糖水质量/(蔗糖水质量+蒸馏水质量)]%计算大鼠的蔗糖偏好指数。与Normal组比较,大鼠的蔗糖偏好指数明显减小,记为造模成功。

1.4各组大鼠行为学评估(强迫游泳实验)

进行强迫游泳实验时,先将玻璃游泳箱内的水温调整至(25±2)℃,将大鼠置于水箱中,水深约为30 cm,每只动物的游泳时长为6 min,包括前2 min为适应时间,记录后4 min内动物游泳累计不动时间,其中动物的不动时间表征如下:动物不再有挣扎趋势;保持直立漂浮姿势,稍见四肢移动以维系其头部在水面以上。

1.5各组大鼠海马组织的病理损伤与神经损伤

待行为评估结束后,戊巴比妥钠麻醉大鼠,留取腹动脉血样5 m L,处死大鼠,无菌剥离大鼠的脑组织,冰浴下分离其海马组织,取部分大鼠的海马组织,常规切片,分别进行HE、尼式染色液,室温避光孵育30 min,PBS清洗,中性树脂封片,光学显微镜下观察,图像分析软件Image J统计尼式小体阳性细胞的比例。

1.6各组大鼠海马组织的超微结构的改变

取部分大鼠的海马组织,常规固定,石蜡包埋,制成的超薄切片,进行醋酸双氧铀-枸橼酸铅双重染色,JEM-2800透射电子显微镜下观察各组大鼠神经元的超微结构改变,图像分析软件Image J统计各组大鼠脑组织中完整线粒体数量的比例。

1.7 TUNEL检测海马组织中的细胞凋亡率

取部分大鼠的海马组织,石蜡包埋,切片,进行TUNEL染色,避光孵育2 h,显微镜下观察,图像处理软件Image J进行统计分析各组样本中的细胞凋亡率。

1.8酶联免疫吸附实验

取各组大鼠的血清,经离心后,按酶联免疫吸附试剂盒要求测定各组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量,同时根据试剂盒要求检测大鼠海马组织中5-HT、5-HIAA、DA水平。

1.9 q RT-PCR实验

将Trizol裂解液加入到大鼠的海马组织样本中,按Trizol试剂盒要求提取总的RNA,Nano Drop 2000分光光度计测定其浓度后,Prime Scrip TM试剂盒合成c DNA,进行q RT-PCR扩增,反应条件如下:预变性95℃5 s;变性95℃5 s;退火60℃60 s,40个循环,通过2-△△Ct来表示各目的基因的相对表达量[9],各基因引物序列见表1。

表1各基因的引物序列

1.10蛋白质印迹实验

取部分大鼠的海马组织,在4℃裂解液中放置30 min,离心,并将上清液稀释,常规方法提取样本中的总蛋白,以50μg样品进行上样,电泳后,转膜,封闭,加入一抗(兔抗大鼠DJ-1、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、Bcl-2、Bax抗体均为1∶500),二抗(1∶1 500)稀释后,室温孵育后,显色30 min,以GAPDH为参照[10],分析目标蛋白的灰度值。

1.11统计学分析

实验所得数据采用SPSS16.0软件进行统计分析,采用Graphpad8.0进行作图,对于各组样本中的细胞凋亡率以及样本中蛋白的表达含量等符合正态分布的数据采用进行表示,多组间比较采用单因素分析,两两比较采用t检验,P<0.05表示具有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠神经行为学与行为学的比较

实验结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠糖水偏好指数明显下降,游泳不动时间明显升高;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠糖水偏好指数明显上升,游泳不动时间明显下降,LY294002组大鼠糖水偏好指数明显下降,游泳不动时间明显升高。

与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组大鼠糖水偏好指数明显下降,游泳不动时间明显升高(P均<0.05)(图1)。

图1 DJ-1对大鼠的神经和行为学的影响

2.2各组大鼠海马组织的病理损伤、神经损伤以及超微结构损伤

各组大鼠海马组织经HE染色后显微镜下观察结果显示,Normal组大鼠脑组织海马组织中的神经元细胞结构清晰,排列规整,细胞饱满,胞浆中细胞器数量丰富,核仁清晰,脑组织中染色均匀;Model组大鼠脑组织海马组织中的神经元细胞排列松散,胞浆中细胞器数量明显减少,核仁明显固缩,炎性浸润明显,结构形态较差;LY294002组大鼠脑组织海马组织中的神经元细胞的排列疏于规整,可见明显的炎性介质的浸润,细胞凋亡与坏死严重,可见一定区域的坏死灶点;pc组大鼠脑组织海马组织的病理出现一定程度的缓解,炎性浸润明显减轻,胞浆中的细胞器的数量明显回升,核质界限趋于清晰;pc+LY294002组大鼠脑组织海马组织损伤与pc组比较明显加重,细胞排列无规则,细胞形态欠规整(图2A)。

尼氏小体的结构与数量的变化可用来评估神经元细胞受损的情况,尼式染色结果显示,Normal组大鼠海马组织中尼式小体结构清晰,排列致密;Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中的尼式小体出现不同程度的溶解或丢失。

统计结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中尼式小体阳性细胞的比例明显下降;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中尼式小体阳性细胞的比例明显升高,LY294002组大鼠海马组织中尼式小体阳性细胞的比例明显下降;与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组大鼠海马组织中尼式小体阳性细胞的比例明显下降(P均<0.05)(图2B)。

电镜下,Normal组大鼠海马组织中的细胞结构完整,线粒体数量丰富,线粒体的双层膜以及嵴结构清晰,排列整齐;Model组大鼠海马组织中神经元的超微结构损伤明显,线粒体呈现严重病变状态,线粒体肿胀明显,嵴结构的数量锐减,呈现空泡样变性,胞质内的内容物大量减少,且结构模糊不清;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织的超微结构损伤明显缓解,而海马组织中LY294002组大鼠海马组织的超微结构损伤明显加重;统计结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中完整线粒体的比例明显下降;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中完整线粒体的比例明显升高,LY294002组大鼠海马组织中完整线粒体的比例明显下降;与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组大鼠海马组织中完整线粒体的比例明显下降(P均<0.05)(图2C)。

2.3各组大鼠海马组织的细胞凋亡

TUNEL染色结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中的细胞凋亡率明显升高。

与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠海马组织中的细胞凋亡率明显下降,LY294002组大鼠海马组织中的细胞凋亡率明显升高。

与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组大鼠海马组织中的细胞凋亡率明显升高(P均<0.05)(图3)。

图2大鼠海马区的损伤

图3大鼠海马组织中的细胞凋亡(×400)

2.4各组大鼠血清中的TNF-α和IL-6的含量

酶联免疫吸附试剂盒结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明显升高;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明显降低,LY294002组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明显升高;与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明显升高(P均<0.05)(图4)。

2.5各组大鼠海马组织中相关递质的含量

酶联免疫吸附试剂盒结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马区中5-HT、5-HIAA和DA的含量明显降低;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组大鼠海马区中5-HT、5-HIAA和DA的含量明显升高,LY294002组大鼠海马区中5-HT、5-HIAA和DA的含量明显降低;与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组大鼠海马区中5-HT、5-HIAA和DA的含量明显降低(P均<0.05)(图5)。

图4大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量

与Normal组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05;与pc组比较,△P<0.05。

图5大鼠海马区中5-HT、5-HIAA和DA的含量

与Normal组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05;与pc组比较,△P<0.05。

2.6大鼠海马组织中相关基因的表达

PCR结果显示,与Normal组大鼠比较,Mode l组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马区中DJ-1、PI3K、AKT、BDNF、TPH2和MAO-A的m RNA的表达明显降低,MPO的m RNA的表达明显升高;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组海马区中DJ-1、PI3K、AKT、BDNF、TPH2和MAO-A的m RNA的表达明显升高,MPO〛的m RNA的表达明显降低,LY294002组大鼠海马区中DJ-1、PI3K、AKT、BDNF、TPH2和MAO-A的m RNA的表达明显降低,MPO的m RNA的表达明显升高;与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组海马区中DJ-1、PI3K、AKT、BDNF、TPH2和MAO-A的m RNA的表达明显降低,MPO的m RNA的表达明显升高(P均<0.05)(图6)。

图6大鼠海马组织中相关基因的表达

与Normal组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05;与pc组比较,△P<0.05。

2.7各组大鼠海马组织中通路相关蛋白的表达

蛋白质印迹结果显示,与Normal组大鼠比较,Model组、LY294002组、pc组、pc+LY294002组大鼠海马区中DJ-1、p-PI3K、p-AKT、Bcl-2的表达明显降低,Bax的表达明显升高;与Model组比较,pc组、pc+LY294002组海马区中DJ-1、pPI3K、p-AKT、Bcl-2的表达明显升高,Bax的表达明显降低,LY294002组大鼠海马区中DJ-1、pPI3K、p-AKT、Bcl-2的表达明显降低,Bax的表达明显升高。

与pc组比较,LY294002组、pc+LY294002组海马区中DJ-1、p-PI3K、p-AKT、Bcl-2的表达明显降低,Bax的表达明显升高(P均<0.05)(图7)。

图7大鼠海马组织中相关蛋白的表达

与Normal组比较,*P<0.05;与Model组比较,#P<0.05;与pc组比较,△P<0.05。

3、讨论

抑郁症是临床上常见的一种内分泌系统、神经系统以及单胺类神经递质协同作用的最终导致患者出现情感性精神障碍的脑部疾病。研究显示患者海马区的炎症性应激、5-HT、5-HIAA和DA等单胺类神经递质功能衰退在抑郁症的病情进展中发挥了重要作用[11]。因此深入揭示抑郁症中海马区中的分子进展机制,积极开发新型药物,成为疾病临床治疗中最具前景的研究方向。

研究证实抑郁症患者大多伴有脑组织海马区的损伤,尤其是海马区单胺类5-HT、5-HIAA和DA等与情感和应激相关的神经递质的缺失,而此类递质的缺失与患者的焦躁、兴致减退以及持续性的情绪低落关系密切[12]。TPH2是海马区合成5-HT中的关键作用酶,而MAO则是5-HT分解成5-HIAA过程必不可少的催化剂[13]。本研究通过CUMS构建大鼠模型后,Model组动物的糖水偏好指数明显下降,游泳不动时间明显升高,大鼠海马组织中5-HT、5-HIAA和DA明显下降,TPH2和MAO-A的表达明显降低,说明造模成功,大鼠出现抑郁样行为。

人DJ-1基因定位在1号染色体,在机体脑、心、肾以及肝、睾丸等器官和组织中广泛存在,研究显示DJ-1是一种具有多功能的小分子,主要参与调控RNA结合功能、炎症性和氧化应激,细胞自噬以及凋亡、线粒体融合-裂变稳态、肿瘤癌基因的激活等多种生理、病理过程[14]。Zhao等[15]研究显示在脑缺血再灌注损伤大鼠模型中,过表达DJ-1后,促进脑组织损伤的修复,明显改善动物的神经功能障碍。本研究中过表达DJ-1后能明显升高大鼠海马区中神经递质5-HT、5-HIAA和DA的含量,减轻大鼠海马区的病理损伤和超微结构损伤,能改善大鼠的神经与行为障碍。

PI3K/AKT信号是一条内源性的转导通路,研究显示在创伤性脑损伤、脑卒中、抑郁症、老年痴呆症等神经系统疾病中,PI3K/AKT发生磷酸化后,能直接调控神经元细胞的增殖、凋亡与衰老等生理过程[16]。本研究中侧脑室注射LY294002后,大鼠海马组织的病理损伤明显加重,海马区的细胞凋亡率明显升高,大鼠的抑郁样症状更为严重;证实PI3K/AKT信号参与疾病的进展。而过表达DJ-1后能明显升高动物海马区p-PI3K、p-AKT的表达,以LY294002做功能挽救实验,结果显示LY294002可部分解除过表达DJ-1对神经元的修复作用,证实过表达DJ-1可能通过激活PI3K/AKT信号来干预疾病进展的。

综上所述,过表达DJ-1后能明显抑制抑郁症大鼠模型海马区的炎症性应激,降低海马区的神经元细胞的凋亡率,上调海马区中5-HT、5-HIAA和DA的含量,改善动物的抑郁样行为,这可能与激活PI3K/AKT信号有关,但是如何将这一靶向作用应用至疾病新药的研发,仍然需要更为系统的研究。

参考文献:

[1]马琴,邵瑞洁,魏高文,等.针刺对慢性应激抑郁大鼠海马AMPK/ULK1信号通路和自噬的影响[J].针刺研究,2024,49(10):1063-1069.

[2]张杰,何福培,林蓓蕾,等.脑卒中高危人群抑郁症状潜在类别分析及影响因素研究[J].现代预防医学,2024,51(19):3643-3648.

[6]卢宇佳,邵晨,张珊,等.电针通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路调节抑郁大鼠糖代谢紊乱[J].针刺研究,2023,48(3):247-252.

[11]孙玉涛,王磊,贾翠娜,等. mi R-185抑制VEGFA导致抑郁症大鼠海马神经元损伤[J].医学分子生物学杂志,2021,18(4):273-279.

基金资助:泰州市凤城英才青年人才托举工程资助项目;泰州市海陵区科技发展计划(社会发展)项目~~;

文章来源:李笑然,蔡云峰,丁兆猛,等.基于PI3K/AKT信号通路探讨DJ-1蛋白对抑郁症大鼠海马中神经递质的影响[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):55-61+75.