妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠最常见的并发症之一,其患病率在不断地上升,与孕产妇和新生儿不良结局风险有关,包括先兆子痫、早产、死产、大于胎龄儿和新生儿高胰岛素血症,并且认为是未来母体和后代心脏代谢疾病的危险因素[1]。研究表明,在GDM发病过程中,胎盘组织炎症的激活在胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)中起关键作用。来自胎盘组织的几种炎性细胞因子参与炎症的激活,并在妊娠期间启动或加重IR[2]。胎盘是一个高度特化的器官,在怀孕期间释放各种细胞因子和激素,并有助于母体IR[3]。由于GDM妇女分娩后IR立即显著改善[4],推测胎盘可能在GDM发病过程中炎症激活和IR启动中起关键作用。然而,GDM胎盘中炎症调节的机制尚不清楚。GDM的治疗主要包括饮食控制、运动、降糖药和胰岛素控制血糖。目前的治疗方法主要集中在血糖的控制上,这些治疗方法从病因上不能完全治愈GDM[5]。因此,深入研究治疗GDM的药物具有重要意义。山柰酚(kaempferol,Kpf)是一种天然植物类黄酮化合物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、神经和心脏保护等多种生理活性[6]。研究发现,Kpf有抑制脂肪生成、调节脂质和葡萄糖代谢、抗炎等作用,是治疗糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性心肌病等糖尿病并发症的潜在治疗药物[7-8]。据报道,Kpf能够显著降低2型糖尿病小鼠的高血糖并改善IR和炎症损伤[9-10]。故本研究推测Kpf可能在GDM进展中发挥作用。研究发现,白细胞介素-6 (interleukine-6,IL-6)/通过激活转录激活子3 (signal transduction and activator of transcriptional 3,STAT3)加快炎症反应,引起糖代谢紊乱,加重糖尿病大鼠的病情进展[11]。Wang等[12]研究表明,抑制IL-6/STAT3通路的激活,有助于减轻炎症与氧化应激反应对糖尿病大鼠视网膜损伤,从而延缓大鼠糖尿病视网膜病变。此外,含Kpf的葶苈大枣泻肺汤能够抑制IL-6表达和STAT3的激活,进而抑制肺部炎症损伤[13]。由此推测,Kpf可能通过调节IL-6/STAT3通路,抑制炎症反应,起到改善GDM的作用。本研究构建了GDM大鼠模型,将对此进行探讨。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级SD大鼠,6～8周龄,雄性200只(260～300) g,雌性100只(180～220) g由郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供[SCXK (豫)2019-0002]。大鼠饲养在(22～26)℃、湿度50%～70%、12 h/12 h光暗循环的动物房内。本研究经承德市妇幼保健院动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂

山柰酚(60010-100 mg,纯度≥97.0%),美国Sigam公司;r IL-6 (cyt-388),西宝生物科技(上海)股份有限公司;链脲佐菌素(STZ,jlcA13694),江西江蓝纯生物试剂有限公司;空腹胰岛素(FINS)、白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1βELISA (MEXN-H5053、MEXN-H0101、MEXN-H0108、MEXN-H0147),上海美轩生物科技有限公司;兔源IL-6、STAT3、p-STAT3、GAPDH一抗及过氧化物酶标记的二抗Ig G(ab259341、ab68153、ab30647、ab9485、ab6721);蛋白提取试剂盒(252001),湖北艾普蒂生物工程有限公司;BCA蛋白定量试剂盒(YZM338),无锡天萃生物科技有限公司;HE染色试剂盒(EY-24367),上海一研生物科技有限公司;TUNEL染色试剂盒(A111-01),南京Vazyme公司。

1.3主要仪器

罗氏血糖仪(ACCU-CHEK),德国罗氏公司;离心机(D1016R),广州洁特生物过滤股份有限公司;多功能酶标仪(Spectra Max),上海逍鹏生物科技有限公司;荧光显微镜(TE2000-U),日本nikon。

1.4动物建模、分组和干预

高脂高糖喂养雌性大鼠8周,将雌雄鼠依据1∶2合笼过夜,每天通过显微镜对雌鼠阴道涂片进行观察,妊娠1 d为观察到精子或阴道栓的日期。妊娠5 d,一次性腹腔注射35 mg/kg的STZ,注射后2、3 d取尾静脉血测量大鼠FBG,测得FBG值均大于或等于13.5 mmol/L,则视为GDM成功造模[14]。将成功造模大鼠依据随机数字表分为Kpf低、中、高剂量组、激活剂组、Model组,每组12只,同批12只妊娠大鼠作为control组(普通饲料喂养,注射等量柠檬酸缓冲液)。造模成功后,Kpf低、中、高剂量组大鼠腹腔注射12.5、25、50mg/kg的Kpf[15],激活剂组腹腔注射50 mg/kg Kpf和0.05 mg/kg IL-6/STAT3通路激活剂r IL-6[16],每天1次,直到妊娠19 d。control组和Model组注射等量的生理盐水。

1.5大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)测量

药物处理结束后,大鼠禁食不禁水12 h。剪尾取血,3 000 r/min离心10 min,分离血清,用罗氏血糖仪测定大鼠的FBG。麻醉大鼠,取腹主动脉血,通过离心取血清液,根据ELISA试剂盒的制造商说明测量大鼠的FINS。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.6大鼠妊娠结局的分析

FBG、FINS测量结束后,麻醉大鼠,行剖腹产手术取出胎鼠,记录窝产子数、胎鼠体重、活胎率。分离胎盘备用。

1.7炎症因子的检测

将胎盘组织切碎,制备成组织匀浆,根据ELISA试剂盒说明书测量胎盘组织中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.8 HE染色

胎盘组织固定于4%多聚甲醛溶液,脱水并包埋在石蜡中,切片机切5μm的薄片,经常规脱蜡和水化后进行苏木精和伊红染色,中性树胶封片后随机选取5个视野镜检。观察组织病理损伤。

1.9 TUNEL染色

使用TUNEL检测试剂盒分析胎盘组织细胞凋亡。将1.7中胎盘组织切片固定、透化,并与末端脱氧核苷酸转移酶和荧光素标记的d UTP在37℃孵育1 h。加入DAPI,对细胞核进行复染。用荧光显微镜测量染色细胞,并分析阳性细胞(绿色)的百分比。

1.10 IL-6/STAT3通路蛋白表达检测

使用RIPA缓冲液从胎盘组织中分离总蛋白。用BCA法定量蛋白浓度。12μg蛋白用20%SDS凝胶分离,蛋白转到PVDF膜。10%脱脂奶粉封闭膜,并与按照1∶1 000稀释的IL-6、STAT3、p-STAT3、GAPDH的一抗在4℃孵育过夜。在室温下用加入过氧化物酶标记的二抗Ig G (1∶2 000)处理1 h。使用Image J软件应用化学发光膜评估蛋白质表达。

1.11统计与分析

计量资料以表示,并用Graphpad Prism 9.0软件进行分析。多组间的比较用单因素方差分析,SNK-q检验用于两组间的比较。P<0.05,差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 Kpf对大鼠血清FINS、FBG及HOMA-IR的影响

与control组比较,Model组FINS、FBG、HO-MA-IR增加(P<0.05);与Model组比较,Kpf低、中、高剂量组FINS、FBG、HOMA-IR下降(P<0.05);与Kpf高剂量组比较,激活剂组上述各指标增加(P<0.05)(表1)。

2.2 Kpf对大鼠妊娠结局的影响

与control组比较,Model组活胎率、窝产子数下降,胎鼠质量增高(P<0.05);与Model组比较,Kpf低、中、高剂量组活胎率、窝产子数增高,胎鼠质量下降(P<0.05);与Kpf高剂量组比较,激活剂组活胎率、窝产子数下降,胎鼠质量增高(P<0.05)(表2)。

2.3 Kpf对大鼠胎盘中炎症因子的影响

与control组比较,Model组IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加(P<0.05);与Model组比较,Kpf低、中、高剂量组上述各因子水平下降(P<0.05);与Kpf高剂量组比较,激活剂组上述各因子水平增高(P<0.05)(表3)。

表1各组大鼠血清中FBG、FINS及HOMA-IR比较

表2各组大鼠窝产子数、活胎率、胎鼠质量比较

表3各组大鼠胎盘中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

2.4 Kpf对大鼠胎盘组织病理损伤的影响

control组胎盘细胞排列紧密且均匀分布、可见清晰细胞核,毛细血管均匀分布。Model组胎盘细胞间隙变大、排列混乱松散,毛细血管扩张充血且分布减少、炎症细胞明显浸润。

Kpf低、中、高剂量组相较于Model组,胎盘细胞排列较紧密、结构和形态逐渐恢复,毛细血管炎性浸润和扩张充血情况相对减轻。

激活剂组相较于Kpf高剂量组,上述病理特征加重(图1)。

图1 HE染色观察大鼠胎盘组织病理损伤(×200)

2.5 Kpf对大鼠胎盘组织细胞凋亡的影响

Model组与control组比较,胎盘组织细胞凋亡率增加(P<0.05);Kpf低、中、高剂量组与Model组比较,凋亡率下降(P<0.05);激活剂组与Kpf高剂量组比较,凋亡率增加(P<0.05)(图2、表4)。

图2 TUNEL染色测量大鼠胎盘细胞凋亡(×200)

表4各组大鼠胎盘细胞凋亡率比较

注:与对照组比较,@P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与Kpf低剂量组比较,&P<0.05;与Kpf中剂量组比较,*P<0.05;与Kpf高剂量组比较,βP<0.05。

与Model组比较,Kpf低、中、高剂量组上述指标水平下降(P<0.05)。

与Kpf高剂量组比较,激活剂组上述指标水平增加(P<0.05)(图3、表5)。

2.6 Kpf对大鼠胎盘中IL-6/STAT3通路蛋白表达的影响

与control组比较,Model组IL-6、p-STAT3/STAT3水平增加(P<0.05)。

图3蛋白质印迹检测胎盘中IL-6/STAT3通路蛋白表达

表5各组大鼠胎盘组织中IL-6/STAT3通路蛋白表达比较

3、讨论

GDM是全世界日益严重的健康问题,严重威胁着孕产妇及幼儿的生命健康[17]。GDM病理机制复杂,涉及遗传和环境等因素。因此,深入研究其发病机制有助于开发安全有效的治疗药物。Kpf来源广泛,可以从传统药物槐花、银杏、高良姜及多种蔬菜和水果中提取,具有广泛的生理活性。Kpf是一种有效的抗糖尿病及糖尿病并发症的潜在治疗药物。Kpf通过调节胰淀粉酶、糖原贮藏和胰岛素分泌,降低糖尿病大鼠的葡萄糖、炎症细胞因子及氧化标志物水平,可用于治疗糖尿病[18]。据报道,Kpf对糖尿病的治疗作用可能是通过提高骨骼肌葡萄糖代谢和降低肝脏糖异生实现的[19]。研究表明,Kpf通过抑制NLRP3炎症小体的激活,降低炎症因子的水平(IL-1β、IL-6和TNF-α等),改善糖尿病肾病小鼠的炎症损伤[15]。本研究发现,用不同浓度的Kpf干预GDM大鼠后,GDM大鼠FBG、FINS、HOMA-IR降低。提示,Kpf降低GDM大鼠血糖,缓解胰岛素抵抗,对GDM有保护和预防作用。

GDM不仅是一种代谢性疾病,也是一种低度炎症反应。炎症与GDM发展密切相关。研究证实胰岛素抵抗是GDM的基础,而炎症在胰岛素抵抗和胰腺β细胞衰竭中起关键作用[20]。研究发现GDM患者胎盘组织及脐动脉血清中IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞的表达增加,GDM引起的炎症破坏胎盘中的稳态,增加了新生儿感染的风险[21]。IL-1β通过NF-κB通路促进胰岛β细胞凋亡,加速IL-8、IL-6等炎症因子分泌。TNF-α是GDM发生的独立危险因素,这与其抑制葡萄糖转运和胰岛素信号传递相关[22]。显然,抗炎也是缓解胰岛素抵抗、调节糖代谢紊乱的重要措施。本研究发现,Kpf可显著降低胎盘中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平,减少胎盘组织细胞凋亡率,改善妊娠结局(胎鼠质量降低,窝产子数、活胎率升高)。这些结果提示Kpf可通过抑制炎症反应,对GDM有保护和预防作用。

IL-6与IL-6受体和辅受体糖蛋白130 (gp130)形成复合物可激活STAT3等途径的信号转导,驱动炎症级联反应。IL-6/STAT3是诱导胰岛素抵抗最重要的炎症途径之一,也与葡萄糖代谢密切相关。许多临床研究表明,糖尿病并发症患者中IL-6/STAT3通路蛋白表达水平较高[23]。研究发现,IL-6/STAT3激活后,可促进炎症反应,加重胰岛素抵抗型2型糖尿病进展[11]。研究发现,IL-6/STAT3通路参与高糖诱导的炎症性疾病的发生发展,抑制该通路可抑制炎症,减少细胞凋亡,从而缓解高糖诱导的细胞损伤[24]。重组抗IL-6R融合蛋白可通过抑制IL-6R/JAK2/STAT3通路,抑制炎症反应,改善肾损伤,进而改善糖尿病肾病进展[25]。本研究发现,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白在GDM大鼠胎盘组织中高表达,Kpf干预后,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平显著降低。IL-6/STAT3激活剂使用后,血糖升高及炎症水平升高,胎盘组织病理损伤加重,妊娠结局较差,IL-6/STAT3激活剂减弱了Kpf对GDM大鼠的保护作用。以上结果说明Kpf可减轻GDM大鼠胎盘炎症,其机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路激活有关。

综上所述,Kpf可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路改善GDM大鼠胎盘炎症,减轻胰岛素抵抗,进而对GDM起治疗作用。但Kpf抗炎作用是否涉及到其他通路,如NF-κB途径仍有待进一步的研究。

参考文献:

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[14]许梦丽,徐琼,崔翠,等.灵芝多糖对妊娠期糖尿病大鼠肝脏损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2020,36(20):3242-3245.

[15]汤利华,方超,王浩然,等.山奈酚对高糖诱导的糖尿病肾病大鼠肾功能和组织病理损伤的保护作用[J].免疫学杂志,2018,34(12):041-1046.

[16]周怡锦,田新磊,祝志朋,等.黄芪甲苷通过抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路调节肺脾气虚反复呼吸道感染模型大鼠的Th17/Treg细胞平衡[J].中药材,2022,45(9):2228-2233.

基金资助:河北省医学科学研究重点课题计划项目(No.20221770)~~;

文章来源:郭艳苓,杨颖,蒋天从.山柰酚调节IL-6/STAT3信号通路对妊娠糖尿病大鼠炎症反应的影响[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):41-47.