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百合地黄汤抑制NLRP3炎症小体激活改善焦虑性抑郁症模型大鼠海马神经元损伤

2021-09-28 114 上传者：管理员

摘要：目的:从NOD样受体热蛋白结构域3（NLRP3）炎症小体探讨经典名方百合地黄汤抗焦虑性抑郁症的作用机制。方法:50只SD大鼠随机分为正常组、模型组、文拉法辛组(13.5mg•kg-1),百合地黄汤高、低剂量组(16,4g•kg-1),每组10只。采用28d慢性束缚应激（6h）联合皮下注射皮质酮(30mg•kg-1)的方法建立焦虑性抑郁症大鼠模型,并从造模第8天起各给药组分别灌胃给予相应药物,正常组和模型组给予等体积蒸馏水,连续给药21d。采用高架十字迷宫评价大鼠焦虑行为,旷场实验评价抑郁行为,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清及海马匀浆液中炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）,白细胞介素-6（IL-6）,白细胞介素-18（IL-18）的含量,蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测海马NLRP3,凋亡相关斑点样蛋白（ASC）,半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）蛋白的相对表达量,苏木素-伊红（HE）染色观察海马组织病理形态,免疫荧光法检测NLRP3,ASC,Caspase-1的平均荧光强度,电镜观察神经元超微结构。结果:与正常组比较,模型组大鼠总穿臂次数（TE）,进入高架十字迷宫开放臂比（OE%）,开放臂停留时间比（OT%）及自主活动评分均显著降低（P<0.01）,焦虑和抑郁样行为显著,血清及海马中IL-1β,IL-6,IL-18含量显著升高（P<0.01）,NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达显著增加（P<0.01）,NLRP3炎症小体激活,海马神经元明显损伤;与模型组比较,百合地黄汤高剂量组大鼠焦虑、抑郁行为均显著改善（P<0.01）,血清及海马IL-1β,IL-6,IL-18含量均明显降低（P<0.05,P<0.01）,海马NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达显著降低（P<0.01）,海马神经元损伤情况得以缓解。结论:百合地黄汤能够通过抑制NLRP3炎症小体的过度激活改善焦虑性抑郁症神经元损伤。

关键词：
NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)
海马
炎症小体
焦虑性抑郁症
百合地黄汤
神经元
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焦虑性抑郁症是一种伴随着显著焦虑情绪的抑郁症，在抑郁症中占比超过40%[1]。该病兼具焦虑症和抑郁症的临床特征，而焦虑症状是导致抑郁症治疗阻碍最主要的影响因素之一[2]。目前，焦虑性抑郁症的病理机制主要涉及单胺神经递质失调、神经内分泌紊乱、突触稳态失衡等方面，尚缺乏深入的分子机制研究。近年来，免疫炎症在神经精神疾病病程演进中所扮演的角色受到广泛关注，机体免疫功能紊乱所引起的中枢炎症反应会损伤神经元，导致神经元的结构功能发生改变。NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3）炎症小体主要存在于固有免疫细胞、巨噬细胞、树突状细胞及中枢的小胶质细胞中，被认为是潜在的抑郁症炎症标志物之一[3]。NLRP3炎症小体是由NLRP3，凋亡相关微粒蛋白（ASC）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1）组成的复合体，其激活后会诱导小胶质细胞合成并释放炎症因子，诱发中枢神经炎症反应，导致脑内神经递质改变以及抑郁症状的出现[4]。

百合地黄汤由百合、生地黄两味药物组成，具有养阴清热、宁心安神的功效，是张仲景《金匮要略》中治疗百合病的主要方剂，现代常作为基础方用于治疗焦虑、抑郁、失眠等疾病[5]。百合地黄汤临床应用广泛、疗效确切、特色鲜明、安全性好，是国家中医药管理局制订的首批《古代经典名方目录》中的方剂，具有很强的开发价值。然而，目前该方的研究主要集中在标准煎液、质量控制、成分分析等药学或基础的药效学方面，较少涉及作用环节与，其能否通过调控免疫炎症发挥治疗疾病的作用未见报道。前期研究发现，百合地黄汤能够显著改善大鼠焦虑和抑郁样行为，缓解海马神经元损伤，其作用途径是否与抑制神经炎症有关，尚需实验证实。本研究以NLRP3炎症小体介导的中枢炎症为切入点，旨在深入阐明百合地黄汤治疗焦虑性抑郁症的功效机制。

1、材料

1.1动物

SPF级健康雄性SD大鼠50只，体质量180～200g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号SCXK（湘）2019-0004，饲养于湖南中医药大学实验动物中心，使用许可证号SYXK（湘）2019-0009，温度（22±2）℃，湿度60%±5%,12h明暗交替，适应性喂养3d后开始实验。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会审查通过，审查号为LLBH-202012040001。

1.2药物与试剂

百合地黄汤由百合30g，生地黄30g组成，药材饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院，经湖南中医药大学王宇红研究员鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》相关规定。参照百合地黄汤标准煎液方法[6]，百合与生地黄分别进行水提，称取药材放入提取罐中，首先加入10倍体积水，浸泡30min，武火煮沸后文火继续煎煮1～1.5h，获得水煎液，继续加入6倍体积水进行煎煮，合并2次水煎液，浓缩，分别制得百合煎液和地黄煎液，合并，浓缩至含生药量1.6g·mL-1。盐酸文拉法辛胶囊（成都康弘药业，批号180912）；皮质酮（北京索莱宝科技有限公司，批号YZ-100227）；大鼠白细胞介素-1β（IL-1β），白细胞介素-6(IL-6），白细胞介素-18(IL-18）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，批号分别为70-EK301B/3,70-EK306/3,70-EK218）；苏木素-伊红（HE）染色液，电镜固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G1003,G1102);NLRP3一抗（英国Abcam公司，批号ab254349);ASC一抗，Caspase-1一抗（美国Proteintech公司，批号分别为10500-1-AP,22915-1-AP）。

1.3仪器

PM-200型大鼠高架十字迷宫（成都泰盟软件有限公司）；SMART3.0动物行为学视频分析系统（西班牙Panlab公司）；MK3型酶标仪（美国Thermo公司）；YD-A型生物组织摊片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；HT7800型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；PrimoVert型光学显微镜（德国Leica公司）；ChemiDocXRS+型凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）；AxioScan.Z1型全自动数字玻片扫描系统（德国Zeiss公司）。

2、方法

2.1动物分组、造模及给药

将50只大鼠随机分为正常组，模型组，文法拉辛组，百合地黄汤高、低剂量组，每组10只。除正常组外，其余组均参考文献[7,8]采用皮质酮注射联合束缚应激的方法建立焦虑性抑郁症大鼠模型，大鼠每天接受6h束缚应激，同时于颈背部皮下注射皮质酮30mg·kg-1，连续造模28d，通过行为学指标观测判定造模成功[9]。于大鼠造模第8天开始灌胃给药，文拉法辛组给予文拉法辛胶囊13.5mg·kg-1·d-1（临床等效2倍剂量），百合地黄汤高、低剂量组根据前期预实验结果分别给予百合地黄汤水煎液16,4g·kg-1·d-1，正常组和模型组均采用等体积蒸馏水灌胃，10mL·kg-1，每天给药1次，连续21d。给药完成后，进行行为学测试，麻醉大鼠，腹主动脉采血，一部分经心脏先后灌注生理盐水和多聚甲醛，待动物全身僵硬后分离脑组织保存于10%甲醛溶液中，一部分直接在冰上分离海马组织，于液氮中速冻，转移至-80℃超低温冰箱保存。

2.2行为学检测

高架十字迷宫实验：记录5min内大鼠分别进入高架十字迷宫开放臂、封闭臂的次数及在开放臂的停留时间，计算总穿臂次数（TE），进入开放臂的比例（OE%）及开放臂停留时间比例（OT%）。旷场实验：大鼠在旷场箱中自由活动30s后，记录4min内的水平跨格次数及垂直活动次数，以两者之和表示其自主活动评分。

2.3ELISA检测大鼠血清及海马炎症因子的表达

制备大鼠海马组织匀浆液，采用ELISA试剂盒检测血清及海马匀浆液中炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18的含量，操作过程按照试剂盒说明书进行。

2.4蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测大鼠海马NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达水平

制备分离胶与浓缩胶，每孔加入蛋白30μg,80V恒压电泳，转膜后5%脱脂奶粉室温封闭2h，洗膜后加入稀释后的一抗（1∶1000),4℃孵育过夜。后加入二抗（1∶2000），室温下孵育2h，采用化学发光法显影，采用ImageJ软件测量各条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，计算目的蛋白的相对表达量，进行统计学分析。

2.5HE染色观察海马组织一般病理形态

取大鼠脑组织梯度脱水、透明、石蜡包埋、切片、脱蜡，行HE染色，将染色后的切片脱水透明，封片，于光学显微镜下观察海马组织病理变化。

2.6免疫荧光法检测海马区NLRP3,ASC,Caspase-1表达

取大鼠脑组织脱水，OCT包埋，冰冻切片，片厚10μm。切片加Tris缓冲液室温浸泡30min,TBS液漂洗2次；山羊血清封闭1h后，加稀释后的一抗（1∶500),4℃孵育过夜；漂洗2次，滴加荧光二抗（1∶200），室温避光孵育2h；漂洗3次，滴加抗荧光淬灭剂进行封片。采用全自动数字玻片扫描仪进行扫描，选取海马区3个视野，应用ImageJ软件分析计算平均荧光强度。

2.7电镜观察海马神经元超微结构

将海马组织切成1mm3小块，先后于2.5%戊二醛和1%锇酸中充分固定，脱水，包埋，超薄切片，片厚50nm，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色后置于铜载网上，电子显微镜下观察神经元超微结构变化。

2.8统计学处理

采用SPSS19.0软件对数据进行统计，实验数据以表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1对大鼠行为学的影响

与正常组比较，模型组大鼠TE,OE%,OT%及自主活动评分均显著降低（P<0.01），提示其具有明显的焦虑和抑郁样特征；与模型组比较，文拉法辛组及百合地黄汤高剂量组TE,OE%,OT%，自主活动评分均明显升高（P<0.05,P<0.01），百合地黄汤低剂量组大鼠自主活动评分明显升高（P<0.05）。见表1。

3.2对大鼠血清及海马炎症因子的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清及海马匀浆液中炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18含量均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，文拉法辛组与百合地黄汤高剂量组大鼠血清及海马组织IL-1β，IL-6,IL-18含量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01），且百合地黄汤在调控血清IL-1β和海马IL-18方面效果更明显。见表2。

3.3对大鼠海马NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠海马NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达显著升高（P<0.01）；经文拉法辛或高剂量百合地黄汤干预治疗后，模型大鼠NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表达均显著降低（P<0.01），低剂量百合地黄汤则能够明显降低Caspase-1的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图1。

3.4对大鼠海马病理形态的影响

正常组大鼠海马神经元排列规则，分布均匀，胞体无空泡现象；模型组部分区域神经元散乱，胞体呈空泡状，可见神经元碎片，密度有一定程度下降；文拉法辛组和百合地黄汤高剂量组损伤现象明显好转，神经元排列规则整齐，数量增加；低剂量组神经元密度较模型组增加，仍可见细胞空泡化及细胞碎片。见图2。

3.5对大鼠海马NLRP3,ASC,Caspase-1荧光表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠海马NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白的平均荧光强度值显著升高（P<0.01）；与模型组比较，百合地黄汤高剂量组NLRP3,ASC,Caspase-1的荧光强度值显著降低（P<0.01），低剂量组ASC和Caspase-1的表达明显降低（P<0.05）。见图3，表4。

3.6对大鼠神经元超微结构的影响

正常组大鼠神经元细胞器丰富，内质网分布均匀，线粒体形态正常，核膜结构清晰，染色质均匀；模型组部分细胞器缺损，胞核皱缩，内质网扩张，线粒体肿胀，整体损伤较为明显；文拉法辛组和百合地黄汤高剂量组神经元各细胞器结构基本保持正常，损伤明显减轻；百合地黄汤低剂量组神经元存在核仁皱缩，内质网扩张等超微结构损伤。见图4。

4、讨论

焦虑性抑郁症属于中医情志病范畴，古代虽无该病名记载，但其类似症状可追溯到东汉张仲景《金匮要略》中的“百合病”，是一种心肺阴虚内热的疾病，以神志恍惚、沉默寡言、情绪怪异、饮食行动失常为表现特征。百合地黄汤是张仲景治疗百合病的主方，方中百合清心安神、滋补精血，生地黄清热生津、滋阴凉血，百合偏于补，清润而不腻，生地黄偏于泻，泻热而不燥，且二者均味甘性微寒，入心经，相合而用，使心肺烦躁之热得清，脑神得安，阴阳得平[10]。现代药理研究表明，百合水煎液能够改善慢性不可预见性应激小鼠的抑郁行为，并升高脑内5-羟色胺（5-HT）水平[11]，其活性成分是百合总皂苷；生地黄提取物能够降低小鼠的悬尾不动时间和强迫游泳不动时间，增加自主活动次数[12]，并有保护海马神经元，促进神经再生的功效[13]，其活性成分是梓醇。大量临床研究表明，百合地黄汤加减治疗原发性抑郁症和继发性抑郁症都有显著的疗效，能够改善患者焦虑抑郁状态，降低汉密尔顿焦虑量表（HAMD）和汉密尔顿抑郁量表（HAMA）评分值，对于失眠症状也有明显的治疗作用[14,15,16]。

近年来抑郁症的免疫炎症学说备受国内外关注，NLRP3炎症小体是潜在的抗抑郁靶点。正常情况下，免疫细胞未受到刺激，ASC位于细胞核内，而在持续的应激状态下，免疫细胞被激活，使ASC由胞核移位到胞浆，与诱导NLRP3炎症小体的热蛋白结构域结合，通过招募Caspase-1前体蛋白进行自切割，产生活化的Caspase-1[17]。活化的Caspase-1是介导炎症反应的执行蛋白，能够将不成熟的白细胞介素-1β前体（pro-IL-1β）和白细胞介素-18前体(pro-IL-18）剪切成活化状态并释放到胞外，IL-1β和IL-18的释放会继续激活炎症相关通路，如核转录因子-κB(NF-κB），导致更多炎症因子的产生，引发炎症反应[18]。炎症反应的发生又会进一步激活NLRP3炎症小体，如此循环反复，介导细胞凋亡或焦亡，诱发疾病。研究表明，抑郁症状态下海马NLRP3炎症小体过度表达呈激活态[19]；而敲除NLRP3基因的小鼠，即使给予慢性不可预见性应激，也并不表现出抑郁样行为[20]。本研究定位-定量探讨了NLRP3小体的表达，发现焦虑性抑郁症大鼠海马NLRP3,ASC,Caspase-1表达显著增加，同时血液与海马组织中炎症因子IL-1β，IL-6,IL-18含量均升高，说明NLRP3炎症小体激活，进而启动炎症反应，诱导外周及中枢炎症因子的产生；给予百合地黄汤干预后，模型大鼠NLRP3小体激活态得以抑制，这可能与其对海马神经元的保护作用有关。