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土家药刺老苞不同极性提取物的HPLC指纹图谱方法验证研究

2024-06-05 59 上传者：管理员

摘要：目的建立一种可用于不同极性刺老苞提取物的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱方法。方法采用HPLC法对色谱条件进行优化，并进行方法学验证。结果色谱条件为Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱，乙腈(A)-0.1%磷酸(B)流动相梯度洗脱，检测波长280 nm，柱温30℃，进样量10μL。方法学验证显示，该HPLC指纹图谱法精密度、稳定性、重复性的相对标准偏差(RSD)符合要求。结论该HPLC指纹图谱法可同时应用于刺老苞不同极性提取物的检验，可初步比较各提取物之间的差异。

关键词：
HPLC
不同极性提取物
刺老苞
土家药
实验研究
指纹图谱
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刺老苞为五加科木属植物楤木（Aralia echinocaulis Hand.-Mazz）及其变种白背叶楤木（Aralia chinensis Linn.var.nuda Nakai），以根皮或茎皮入药，始载于《本草拾遗》[1]。刺老苞主要分布于我国西南地区，生于山地林缘、林中或路旁灌木丛中，野生资源丰富；其味辛，性平，归胃、肝、肾经，具有滋阴健肾、祛风湿、壮筋骨等功效，可用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、骨折等[2]。

中药、民族药的质量与其化学成分有着密切的关系，对化学成分的研究可在一定程度上把控药材的质量。指纹图谱技术被认为是一种综合的鉴定方法[3]，专属性强，可用于对药材中未知和已知成分的分析。目前，对土家药刺老苞的指纹图谱相关报道较少。本实验通过优化高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的色谱条件，确定了一种适用于土家药刺老苞三种不同极性提取物的指纹图谱检验方法，并进行了方法学验证。详细如下。

1、仪器与材料

1.1仪器

SPD-M20A型高效液相色谱仪（日本岛津制作所），UC-6型超声波清洗机（上海泰坦科技股份有限公司），DK-98-II型水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），C22-CS03型电陶炉（浙江苏泊尔股份有限公司），Best-S15FV型超纯水机[芷昂仪器（上海）有限公司]。

1.2材料

色谱乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20210222），色谱甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20210427），乙醇[重庆川东化工（集团）有限公司，批号20201201]，磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20211025），乙酸乙酯（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20210619）；自制超纯水。

2、方法与结果

2.1供试品溶液的制备

刺老苞饮片经贵州中医药大学生药学教研室孙庆文教授鉴定，为五加科木属植物楤木（Aralia echinocaulis Hand.-Mazz）药材饮片。

2.1.1醇提供试品溶液制备

精密称取刺老苞2.00 g，置于圆底烧瓶内，加入75%乙醇100 mL，称重，浸泡30 min；水浴回流1 h，冷却，补重，过滤；滤液用0.22μm微孔滤膜滤过即得。

2.1.2水提供试品溶液制备

精密称取刺老苞2.00 g，置于锥形瓶内，加入纯水100 mL，称重，浸泡30 min；回流煎煮1 h，冷却，补重，过滤；滤液用0.22μm微孔滤膜滤过即得。

2.1.3乙酸乙酯供试品溶液制备

精密称取刺老苞2.00 g，置于圆底烧瓶内，加入75%乙醇100 mL，称重，浸泡30 min；水浴回流1 h，冷却，补重，过滤；滤液蒸干，加50 mL纯水溶解，用1∶1乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；萃取液蒸干，用30 mL乙腈溶解，溶液用0.22μm微孔滤膜滤过即得。

2.2色谱条件考察

本实验对波长、流动相、洗脱程序、流速、柱温、进样体积等进行考察，根据色谱图出峰个数、分离度、峰面积、峰型等信息，确定色谱条件。即色谱柱为Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5μm）；流动相为乙腈（A)-0.1%磷酸（B）；梯度洗脱，其中流动相A的比例变化为0～7 min,3%～10%A;7～15 min,10%～13%A;15～25 min,13%～15%A;25～35 min,15%A;35～40 min,15%～20%A;40～55 min,20%～28%A;55～70 min,28%～35%A;70～75 min,35%～45%A;75～80 min,45%～25%A;80～81 min,25%～3%A;81～90 min,3%A；检测波长为280 nm，柱温为30℃，进样量为10μL。见图1～图6。

2.3方法学考察

2.3.1醇提物方法学考察

分别精密称定刺老苞药材8份，各2.00 g，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液8份。1份供试品溶液按“2.2”项下的色谱条件连续6次进样测定，1份于0、3、6、9、12、24 h内测定，其余6份用于重复性实验，记录各色谱图信息。以29.42 min的色谱峰为参照峰，计算特征图谱中各共有峰的相对峰面积（Relative peak area,RPA）。结果显示，色谱图中各共有峰的精密度、稳定性RPA的相对标准偏差（RSD）值均小于3%，重复性RPA的RSD值均小于5%，证明醇提物的方法学考察实验符合规定。见表1。

2.3.2水提物方法学考察

分别精密称定刺老苞药材8份，各2.00 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液8份。同“2.3.1”项方法进样并记录。结果显示，色谱图中各共有峰的精密度、稳定性RPA的RSD值均小于3%，重复性RPA的RSD值均小于5%，证明水提物的方法学考察实验符合规定。见表2。

2.3.3乙酸乙酯提取物方法学考察

分别精密称定刺老苞药材8份，各2.00 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液8份。同“2.3.1”项方法进样并记录。结果显示，色谱图中各共有峰的精密度、稳定性RPA的RSD值均小于3%，重复性RPA的RSD值均小于7%，证明乙酸乙酯提取物的方法学考察实验符合规定。见表3。

图1检测波长考察色谱图

图2流动相考察色谱图

图3洗脱程序考察色谱图

图4流速考察色谱图

图5柱温考察色谱图

图6进样体积考察色谱图

表1醇提供试品溶液方法学考察共有峰RPA

表2水提供试品溶液方法学考察共有峰RPA

表3乙酸乙酯提供试品溶液方法学考察共有峰RPA

3、讨论

目前，对刺老苞化学成分的研究发现，其主要含有三萜皂苷、多糖类、生物碱等，但对其不同极性提取物的化学成分研究较少。中药、民族药具有多成分、多靶点、整体性的特点，现有的一些分析方法无法全面、系统地揭示其内在质量。中药指纹图谱是一种可反映其内在化学成分的种类与数量，进而反映中药质量的方法，将有效地表征中药质量[4]。

刺老苞根皮水提物可促进成骨细胞增殖，同时可加速软骨修复，提前进入骨化和塑形期，促进骨折愈合[5,6]；醇提物可通过促进成骨细胞增殖和分化，加快骨基质矿化过程，也可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进自噬，抑制炎性因子的表达[7,8]。研究[9,10]显示，青海楤木乙酸乙酯提取物具有显著的降血糖效果，长白楤木乙酸乙酯提取物具有抗炎作用。因此课题组采用HPLC法，通过对色谱条件考察，对比不同色谱条件下色谱图出峰情况及分离度，最终建立了一种可同时用于刺老苞三种不同极性提取物的指纹图谱方法，该方法经方法学验证，精密性、稳定性、重复性均良好，表明本实验建立的刺老苞不同极性提取物的HPLC指纹图谱方法稳定可靠。

本实验结果显示，刺老苞醇提物和水提物色谱图具有高度相似性，均含有较多极性大的化学成分；从药理作用看，二者也均能促进成骨细胞增殖，预防骨质疏松。乙酸乙酯提取物的色谱图显示，其含有较多极性小的化学成分，与水提物、醇提物差异明显，因此药理作用也存在差异。

综上所述，结合刺老苞不同提取物药理作用的文献研究及本次指纹图谱实验结果，将会为其不同极性提取物在抗骨质疏松、抗炎、降血糖等方面提供更加准确的理论支撑，为新药研发提供新思路。

参考文献:

[1]尚志钧.《本草拾遗》辑释[M].合肥:安徽科学技术出版社,2002:128.

[2]方志先,赵晖,赵敬华.土家族药物志[M].北京:中国医药科技出版社,2007:830-835.

[4]陶金华,狄留庆,文红梅,等.中药指纹图谱谱效相关性研究思路探讨[J].中国中药杂志,2009,34(18):2410-2413.

[5]燕梦云,依香叫,李金诚,等.刺老苞根皮水提物对成骨细胞TGF-β/BMPs信号通路的影响[J].药物评价研究,2017,40(11):1541-1544.

[6]尹霞,李莉,郑玲玲,等.刺老苞根皮水提物对骨折愈合相关因子受体表达的影响[J].中国骨伤,2011,24(9):761-765.

[7]郝润璇.基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨刺老苞抑制RA滑膜增殖的作用及机制[D].恩施:湖北民族大学,2020.

[8]李金诚,燕梦云,王松月,等.刺老苞根皮醇提物对原代成骨细胞增殖､分化和矿化的影响[J].中国中医基础医学杂志,2018,24(10):1484-1486,1491.

[9]李怡,陈湘宏.青海楤木不同提取物对小鼠血糖的影响[J].大家健康(学术版),2015,9(19):7-8.

[10]李丹娇.长白楤木乙酸乙酯提取物抗炎活性成分研究[D].延吉:延边大学,2015.