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“疏肝降脂”针法治疗非酒精性脂肪肝动物模型及疗效

  2021-12-13    66  上传者:管理员

摘要:目的探讨"疏肝降脂"针法治疗非酒精性脂肪肝的动物模型及评价方法。方法将40只SD大鼠随机分为空白组(n=8)与实验组(n=32),实验组采用88%鼠粮+10%猪油+2%胆固醇喂养,诱发非酒精性脂肪肝,造模成功后,随机分为模型组(n=8)、针灸治疗组(n=12)、阳性药物对照组(n=12)。空白组与模型组正常喂养,阳性药物对照组给予多烯磷脂酰胆碱胶囊灌胃,4g/100g,每天3次。针灸治疗组选取肝俞、脾俞、足三里、中脘、丰隆,每日1次,每次20min。各组均观察1个月。分析各组血脂水平,观察各组肝脏PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白及mRNA水平。结果模型组血脂TG水平有显著增加;HE染色有显著性脂肪性病变;脂质代谢相关基因PPARα、PGC-1α的mRNA转录水平降低,UCP2基因转录水平升高,与之相对应蛋白表达水平有相应变化。针灸之后血脂数值趋于空白组;针灸之后肝脏组织病理变化改善明显脂质空泡变少;脂质代谢相关基因转录和蛋白表达趋于空白组。结论"疏肝降脂"针法治疗非酒精性脂肪肝动物模型疗效显著。

  • 关键词:
  • 多烯磷脂酰胆碱(PPC)
  • 疏肝降脂
  • 肥胖
  • 针灸
  • 非酒精性脂肪肝
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脂肪肝属于良性病变,但最终可导致肝细胞纤维化,甚至肝硬化与癌变[1]。非酒精性脂肪肝(NAFLD)在人们追求饮食享受的过程中逐渐发展为一种社会疾病。由于目前尚缺乏有效的治疗方法,且发病年龄日趋下降与发病率逐渐上升,已引起了相关研究人员的高度关注。研究表明,肝组织PGC-1α、PPARα等的基因表达水平与NAFLD的形成和发展关系密切[2],而且PGC-1α、PPARα信号通路直接或间接参与白色和褐色脂肪代谢活动,促进能量与脂肪的代谢,进而减少脂质沉积。中医治疗NAFLD疗效显著[3,4],针灸可起到疏肝降脂作用,故“疏肝降脂”针法的相关穴位与PPARα、PGC-1α信号通路具有可能潜在的相关性。本研究探讨疏肝降脂针法治疗NAFLD的作用机制。


1、材料与方法


1.1 实验动物

选择SPF级SD雄性大鼠40只,体质量160~200g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号:SCXK(辽)2020-0001。

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司,批号:20181023;甲醛,国药集团化学试剂有限公司,批号:20170912;二甲苯,广东光华科技股份有限公司,批号:20200902;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒,碧云天,批号:c0105s;高线切片石蜡,上海华永石蠟有限公司,批号:20171106;中性树脂,国药集团化学试剂有限公司,批号:20130619;蛋白Marker,碧云天,P0068BCA;蛋白浓度测定试剂盒,碧云天,批号:P0012S;抗UCP2抗体,博士德生物,批号:A02256-1,无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司,批号:20181023;ddH2O,北京鼎国昌盛生物技术有限公司,批号:B14100140;PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTimeTakara,批号:AKF1919A。脱水机,Leica,产品型号:TP1020;包埋机,Leica,产品型号:EG1150H;切片机,Leica,产品型号:RM2235;显微镜,Olympus,产品型号:IX73。

1.3 动物分组

将大鼠随机分为空白组(n=8)与实验组(n=32)。将实验组大鼠采用88%鼠粮+10%猪油+2%胆固醇喂养,诱发NAFLD,造模成功后,随机分为模型组(n=8)、针灸治疗组(n=12)、阳性药物对照组(n=12)。

1.4 方法

空白组与模型组正常喂养,阳性药物对照组给予多烯磷脂酰胆碱胶囊灌胃,4g/100g,每天3次。针灸治疗组选取肝俞、脾俞、足三里、中脘、丰隆,每日1次,每次20min,各组均观察30d。

1.5 观察指标

1.5.1 血脂检测

取血前禁食禁水12h,腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠(0.4ml/100g),抽取腹主动脉血约5ml,10min4000r/min离心取上层血清,采用罗氏CobasC701全自动生化分析仪和检测罗氏C701生化试剂检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.5.2 HE染色石蜡切片的制作过程

(1)取材与固定:取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0.5cm)投入预先配好的固定液中(10%甲醛溶液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固,以防止细胞死后的自溶或细菌的分解,从而保持细胞本来的形态结构。(2)脱水透明:一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂(80%酒精12h,90%酒精12h,95%酒精1h,95%酒精1h,100%酒精1h,100%酒精1h),逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于酒精,又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明,以二甲苯替换出组织块的中酒精,才能浸蜡包埋。(3)浸蜡包埋:将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中,放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋:先制备好容器,倒入已溶化的石蜡,迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬,才能在切片机上切成很薄的切片。(4)切片与贴片:将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成薄片,一般为5μm厚。切下的薄片往往皱折,要放到加热的水中烫平,再贴到载玻片上,放45℃恒温箱中烘干。(5)脱蜡:常用HE染色,以增加组织细胞结构各部分的色彩差异,利于观察。染色前,二甲苯脱去切片中的石蜡,再经由高浓度到低浓度酒精(95%酒精12h,85%酒精12h,75%酒精1h,50%酒精1h),最后入蒸馏水,行HE染色。(6)染色:①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色10min。②酸水中分色,各数秒钟。③流水冲洗入蒸馏水片刻。④入酒精伊红染色液染色2min。(7):脱水透明:染色后的切片经纯酒精脱水,再经二甲苯使切片透明。(8)封固:将已透明的切片滴上树脂,盖上盖玻片封固。待树脂略干后,贴上标笺,切片标本就可使用。

1.5.3 蛋白操作

取大鼠肝组织加入液氮剪碎并研磨,加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂混合物(100∶1)置于冰上30min,10min12000r/min离心后收集上清液,参照BCA蛋白浓度测定试剂盒,测定肝组织中总蛋白浓度,配制12%分离胶、5%浓缩胶,取20μg蛋白上样,待蛋白样品刚进入浓缩胶时电压设置为80V,进入浓缩胶和分离胶分界线后,电压升高至120V,电泳结束后,目的蛋白凝胶转移到PVDF膜上,冰上进行转膜,电流为250mA,反应时间90min,将目的条带剪下,结束后用碧云天洗涤液清洗,加入碧云天封闭液进行10min封闭,洗涤液溶液清洗后,分别加入一抗(抗-UCP2抗体、PPARα兔单克隆抗体、PGC1α兔单克隆抗体,稀释倍数均为1∶1000),摇床过夜,洗涤液清洗后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(稀释倍数1∶1000),室温下孵育70min,洗涤液清洗后,ECL显色置于凝胶成像仪中观察各组蛋白表达情况。实验采用ImageJ软件对Western印迹条带进行采集分析,并计算目的条带相对值。

1.5.4 肝脏总RNA提取

①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从大鼠腹部解剖开,从中取出完整的肝脏组织,置于离心管后立即放入液氮中;②组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有1mlTrizol的1.5ml离心管中,充分混合后于4℃,12000r/min离心15min;③取上清移至新1.5ml离心管中,加入200μl氯仿,剧烈震荡直至呈乳白色,于4℃,12000r/min离心15min;④取上清移至新1.5ml离心管中,加入500μl异丙醇,轻轻颠倒10次,冰上放置20min,于4℃,12000r/min离心15min;⑤弃上清,加入1ml75%乙醇(用DEPC水现配现用),于4℃,12000r/min离心5min,重复此步骤一次;⑥弃上清后,室温干燥5~7min;⑦加入适量(20~30μl)的DEPC水溶解沉淀65℃溶解,-20℃保存,检测RNA浓度,并电泳检测。

1.5.5 RNA浓度测定和电泳检测

取2μl提取好的RNA溶液,于Nanodrop2000Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度,纯净RNA的A260/A280应在1.8~2.2。电泳检测:1%琼脂糖,1×ATE缓冲液,90V电泳30min,凝胶成像系统观察,并分析结果。

1.5.6 肝脏cDNA合成

反应按照TaKaRa公司的PrimeScript®RTreagentKitWithgDNAEraser(PerfectRealTime)反转录试剂盒说明书进行,合成cDNA模板。(1)(残存的)基因组DNA的除去反应,在PCR管中配制如下缓冲液。混合均匀后,室温放置20~30min缓冲液具体配制用量,缓冲液试剂与用量:5×gDNAEraserBuffer,2.0μl;gDNAEraser,1.0μl。(2)反转录反应,在PCR管中配制如下缓冲液(20μl),反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,先按反应数+1的量配制MasterMix,然后再分装到每个反应管中。反转录反应试剂与用量:5倍PrimeScript®Buffer2(forRealTime),4.0μl;PrimeScript®RTEnzymeMixI,1.0μl;RTPrimerMix,1.0μl。(3)混合均匀后,在PCR仪上进行逆转录反应,反应条件为:37℃,15min;85℃。然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。

1.5.7 实时定量PCR

以β-actin作为内参,在实时定量PCR仪(CFX96)中扩增,并测定扩增曲线。反应体系为:1μl引物(浓度:10μmol/L),8.5μlRNase-freewater,12.5μlTBGreen,2μlcDNA(逆转后稀释10倍),反应结束后读取CT值,并计算2-ΔΔCt,分析各基因表达情况,引物序列分别为:PGC-1α正义链5′-TTCAGGAGCTGGATGGCTTG-3′,反义链5′-GTGAGGACCGCTAGCAAGTT-3′;PPARα正义链5′-AGTCCTGGAACTGAAGCGAC-3′,反义链5′-GTTGAATGGTTGTGGCCAGG-3′;UCP2正义链5′-GCAGTTCTACACCAAGGGCT-3′,反义链5′-GGAAGCGGACCTTTACCACA-3′;β-actin正义链5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′,反义链5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

1.6 统计学方法

运用SPSS23.0统计软件进行t检验。


2、结果


2.1 针灸对非酒性脂肪肝大鼠血脂的影响

与空白组相比,模型组和阳性药物对照组TC、TG及LDL-C明显升高(P<0.05),HDL-C明显降低(P<0.05)。针灸治疗组血脂趋于空白组。见表1。

2.2 针灸改善高脂饮食肝脏组织病理变化

SD大鼠造模成功后HE染色,肝脏细胞肿胀,可见弥散性脂质空泡,经过阳性对照药和针灸之后组织病理变化改善明显脂质空泡变少。见图1。

2.3 针灸调节高脂饮食肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2

mRNA表达与模型组相比,针灸治疗组肝脏组织中脂质相关代谢基因UCP2表达降低(P<0.05),而解耦联蛋白PPARα、PGC-1α表达升高(P<0.05),对引起损伤急性肝细胞凋亡有促进作用,见表1。

2.4 针灸调节高脂饮食肝脏组织PPARα、PGC-1α、UCP2蛋白表达

与空白组相比,模型组SD大鼠肝脏组织中脂质相关代谢蛋白PPARα、PGC-1α表达降低(P<0.05),而解耦联蛋白UCP2表达增加(P<0.05)。经过针灸干预之后,PPARα、PGC-1α表达升高(P<0.05),解耦联蛋白UCP2表达降低(P<0.05),趋于空白组。见图2,表2。


3、讨论


中医中虽无NAFLD病名,但依据NAFLD临床症状与发病原因可归于中医学“积聚”“肥”“肝癖”“痰痞”“胁痛”等范畴[5,6],其病变部位在肝,其形成与肝、胆、肾、脾的生理功能失常密切相关。临床治疗一般应从脾肾亏虚论治,且须肝脾同调,健脾利湿,疏肝降脂。NAFLD病因以湿盛痰瘀为主,多因起居失常、气机不利、情志失调、久病体虚而致正气不足、邪气上逆、湿邪困脾,终致多脏功能失调。临床治疗大多以健脾清热,疏肝降脂为法,化痰祛浊,活血化瘀为则,常需大剂量药物长期治疗,重剂起沉疴。

多烯磷脂酰胆碱胶囊为从植物中提取,可对脂环醇、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、四氯化碳、氨基牛乳糖和乙醇等诱导的急性肝损伤具有肝脏保护作用,修复肝细胞膜,亦有抑制纤维化和脂肪变性功效,临床中常用于辅助治疗急慢性肝炎,药物性肝损伤,肝硬化与肝衰竭等,改善脂质代谢,疗程不少于90d[7,8,9]。张明丽等[10]运用多烯磷脂酰胆碱胶囊(易善复)为治疗组治疗NAFLD,与运用肌苷片和维生素C治疗进行治疗的对照组进行统计比较,治疗3个月后,治疗组临床症状、血脂、B超检查结果、肝功能改善情况均优于对照组,表明易善复治疗NAFLD可取得良好的临床疗效。

本研究通过多年临床经验,提出运用“疏肝降脂”针法来治疗非酒精性脂肪肝,临证多选用期门、丰隆、中脘、足三里、三阴交、太冲等穴,结合中医脏腑辨证,标本兼治,内外同调,攻补均施,调气血,补津液,每获良效,为临床中治疗本病提供了新的思路。本研究中所选用穴位中,肝俞益肝通络、疏肝理气,针刺可治疗肥胖、肝气郁滞型慢性胆囊炎、肝气郁结型神志等多种疾病[11,12];脾俞益气健脾,利水湿、助运化,治疗高脂血症疗效确切[13,14];足三里燥脾化湿,生发胃气,临床针灸此穴,无论配伍他穴还是单用本穴,艾灸还是针刺,均有显著的调脂功效,且具有双向调节作用,为临床调脂要穴[15,16],中脘、丰隆通调脾胃气机,使气行津布,且与足三里联合应用,疗效更佳[17,18]。

本实验表明“疏肝降脂”针法治疗NAFLD动物模型疗效显著。


参考文献:

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文章来源:王喜臣,赵杰,贾炳超,刘新宇,胡英华.“疏肝降脂”针法治疗非酒精性脂肪肝动物模型及疗效[J].中国老年学杂志,2021,41(23):5275-5279.

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