在过去的几年里，癌症的免疫治疗已经成为现实，FDA批准了用于晚期前列腺癌的治疗性癌症疫苗（Provenge）、用于晚期黑色素瘤的溶瘤病毒T⁃vec，用于白血病的两种CAR⁃T细胞，以及用于多种癌症的多种基于抗体的免疫检查点阻断药物。免疫疗法正在迅速发展，通过激活患者的免疫系统来治疗癌症是一种很有吸引力的治疗策略[1-2]。一种很有前景的策略是过继细胞疗法（Adoptive cell therapy,ACT），利用患者自身的TILs的一种个性化的癌症免疫疗法[3]。研究表明，在转移性葡萄膜黑色素瘤（一种低突变负担、非免疫原性肿瘤）患者中，从肿瘤反应性TILs中分离出的自体TILs的ACT可诱导客观肿瘤消退[4]。局部免疫治疗，包括溶瘤病毒治疗，可以调节肿瘤免疫环境，将肿瘤从免疫“冷”转化为“热”[5]。我们假设，细胞因子武装的溶瘤病毒可以在免疫原性差的肿瘤中创造局部促炎环境，提高肿瘤反应性T细胞水平，这些T细胞可以用于癌症的ACT。溶瘤病毒（Oncolytic virus,OVs）在体内选择性地感染和/或复制癌细胞，使正常细胞不受伤害。溶瘤病毒诱导的免疫原性细胞死亡暴露了肿瘤相关抗原的天然库，激活损伤相关分子模式分子（DAMPs）和病毒衍生的病原体相关分子模式分子（PAMPs），以及炎症因子，以逆转肿瘤诱导的免疫抑制并引发抗肿瘤细胞免疫。临床前研究临床试验均显示[6-7]，溶瘤病毒可诱导强效的适应性抗肿瘤免疫，有助于提高治疗的总体疗效。为了进一步提高抗肿瘤免疫能力，本文设计多种溶瘤性VV来表达肿瘤抗原、T细胞共刺激分子、炎症趋化因子和细胞因子，并在大鼠骨肿瘤模型中探讨其可行性。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象

SPF级、雄性大鼠45只，8月龄，体质量400～450 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2020⁃0004。动物伦理委员会批文号：2022⁃08⁃131。多发性骨髓瘤细胞购自上海懋康生物科技有限公司。

1.1.2主要试剂和仪器

免疫荧光染色试剂盒（南京凯根生物）、Foxp3和IFN⁃γ细胞内染色试剂盒（BioLegend）、免疫组化试剂盒（默克生物）、酶联免疫吸附试验试剂盒（上海酶联生物）、等。Couvter型高速冷冻离心机（美国Beckman),DM750型光学显微镜、共聚焦显微镜（日本Olym⁃pus),Spectra Max M5型多功能酶标仪（美国Molec⁃ularDevices);RM2235型石蜡切片机（德国Lei⁃ca）、定量PCR仪器（赛默飞世尔科技），等。

1.2方法

1.2.1模型制备及干预方案

大鼠模型及干预：所有大鼠获取后均正常喂养7 d，将细胞密度为2×108/L的多发性骨髓瘤细胞于大鼠左后肢背部篇皮下接种10μL，接种完成后正常喂养，肿瘤体积>100 mm3确认建模成功。随机分组后分别给予生理盐水（对照组）及溶瘤病毒诱导下过继细胞（VVDD⁃CCL5、VVDD⁃CxC11、VVDD⁃IL15Rα、VVDD⁃IL2）干预：WR菌株衍生的重组溶瘤病毒，分别表达膜结合IL⁃2的vvDD、vvDD⁃ccl5和vvDD⁃cxc11、vvDD⁃il15⁃rα和vvDD⁃il2。VVs在HeLa细胞中扩增并进行纯化。瘤内注射病毒的剂量为每只小鼠108pfu。干预后10 d每组随机抽取5只大鼠进行细针穿刺获取肿瘤组织，评估其肿瘤反应性T细胞CD8+TILs表达。所有大鼠在肿瘤直径超过20 mm时处死或其自然死亡后提取肿瘤组织保存待测。

体外实验：收集肿瘤，切成块，在消化缓冲液中37°C孵育，然后在100μmol/L组织过滤器上粉碎。使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。白细胞分离采用Percoll梯度离心机程序，在40%和80%不连续Percoll梯度的界面处收集白细胞，然后进行磁分离。T细胞在含30 IU/ml IL⁃2 (MiltenyiBio⁃tec）和5 ng/ml IL⁃7的RPMI完全培养液中以每孔1.0×106个细胞的浓度在24孔板中培养4 d。作为对照T细胞，取未携带肿瘤的未处理小鼠的脾脏，进行单细胞悬浮，然后磁分离。对照T细胞在与病毒诱导T细胞相同的条件下培养。在过继细胞转移之前，在共培养实验中分析了T细胞的肿瘤特异性。使用IFN⁃γ ELISPOT测定或流式细胞术分析。

1.2.2流式细胞术检测

将收集的肿瘤组织切碎，在含有2%FBS、1 mg/mL胶原酶IV、0.1 mg透明质酸酶、200U dna酶I的RPMI 1640培养基中，37℃孵育1h，制成单细胞α⁃CD16/32 Ab，然后用100μL Zombie Aqua Fixable Viability KiT细胞染料以1∶1 000的稀释度对细胞进行染色，室温下黑暗保存15 min。用抗体在总染色量为100μL (50μL BV染色缓冲液，50μL 2%FBS）的条件下，以1∶200稀释，在冰上黑暗中染色30 min。根据Foxp3和IFN⁃γ细胞内染色试剂盒说明进行染色。细胞用FACS缓冲液洗涤1次，用1%多聚甲醛固定，然后在4℃下保存过夜，第2天在BD LSR Fortessa II分析仪上采集。使用流式细胞仪软件分析数据。

1.2.3酶联免疫斑点（ELISpot）法

将收集的肿瘤组织切成块，在消化缓冲液中37°C孵育，然后在100μmol/L组织过滤器上粉碎。使用ACK Lysing缓冲液裂解红细胞，通过40μmol/L滤池过滤细胞悬液进行单细胞悬液。CD8+TILs的分离采用负α⁃小鼠CD8微珠分离方案。96孔板（涂有抗小鼠IFN⁃γ单抗15 mg/ml。T细胞（每孔2.0×104）不受刺激，或用γ辐照的MC38肿瘤细胞（96孔板中每孔2.0×104）或无关靶细胞γ辐照的肿瘤细胞（每孔2.0×104），重复照射24 h。适当洗涤后，生物化二抗克隆r4⁃6a2⁃生物素，加入并在室温下孵育2 h。随后使用Vectastain Elite ABC和AEC过氧化物酶底物试剂盒进行斑点培养。通过ImmunoSpotTM分析IFN⁃γ斑点的数量。

1.2.4免疫荧光染色

切除的肿瘤在2%多聚甲醛中固定2 h，在30%蔗糖中孵育过夜。切片（5μm），用联合一抗CD3 Alexa 488、CD4 Alexa 594和CD8 Alexa 647染色，细胞核用Hoechst染料（双苯并胺）标记。在每种情况下，从多个领域数字化获取图像。阳性细胞密度通过使用Nikon Elements的自动图像分析进行评估。每个区域的CD3+T细胞、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞的百分比通过抗体阳性细胞数与细胞总数的比值计算。

1.3统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素ANOVA检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1溶瘤病毒诱导下过继细胞干预IFN⁃γ阳性表达

干预10 d后可见VVDD⁃IL 2治疗的肿瘤具有较高的肿瘤反应性CD8+TILs频率，VVDD⁃IL 2组大鼠IFN⁃γ阳性斑点表达高于其他组别（P<0.05）（图1）。

图1溶瘤病毒诱导下过继细胞干预大鼠IFN⁃γ阳性表达

*P<0.05;**P<0.01

2.2溶瘤病毒诱导下过继细胞干预大鼠CD3+、CD4+、CD8+细胞表达

VVDD⁃IL 2组CD3+、CD4+、CD8+细胞表达高于对照组（P<0.05),VVDD⁃IL 2组生存时间[（45.72±9.18)d]高于对照组[（22.35±4.51)d](t=6.855,P<0.01）（表1、图2）。

表1溶瘤病毒诱导下过继细胞干预大鼠CD3+、CD4+、CD8+细胞表达（%，Mean±SD)

图2溶瘤病毒诱导下过继细胞干预大鼠CD3+、CD4+、CD8+细胞表达（免疫荧光染色，Bar=100μm)

2.3溶瘤病毒诱导下过继细胞干预大鼠CTLA⁃4、TIM⁃3、PD⁃1highTIM⁃3+、Foxp3+CD4+表达

VVDD⁃IL 2组CTLA⁃4、TIM⁃3表达高于对照组，PD⁃1highTIM⁃3+、Foxp3+CD4+表达低于对照组（P<0.05）（表2）。

表2溶瘤病毒诱导下过继细胞干预大鼠CTLA⁃4、TIM⁃3、PD⁃1highTIM⁃3+、Foxp3+CD4+表达（%，Mean±SD)

2.4溶瘤病毒诱导下过继细胞干预初始T细胞、TCM、TEM、4⁃1BB表达

VVDD⁃IL 2组TCM、TEM、4⁃1BB表达高于对照组，初始T细胞表达低于对照组（P<0.05）（表3）。

表3初始T细胞、TCM、TEM、4⁃1BB表达（%，Mean±SD)

2.5体外实验结果

体外实验结果显示肿瘤细胞中VVDD⁃IL 2干预后IFN⁃γ、4⁃1BB表达高于未干预（P<0.05），正常细胞中两组差异无统计学意义（P>0.05）（表4）。

表4体外实验结果（Mean±SD)

3、讨论

以多发性骨髓瘤等为代表的骨肿瘤是临床常见的恶性肿瘤，目前质量方案多集中于放、化疗杀灭患者肿瘤细胞，缓解患者症状，但疗效并不理想[8-9]。使用自体TILs的ACT代表了一种个性化的癌症免疫治疗策略，针对患者肿瘤表达的共享和独特的肿瘤抗原[10]。利用患者自身的TILs来治疗癌症的ACT已经成为一种成功的全身治疗方法，治愈了许多晚期黑色素瘤患者和其他一些肿瘤类型，其方案主要为抑制性TME通过预备的非清髓化疗方案（环磷酰胺和氟达拉滨），然后静脉注射体外扩展TILs，随后注射IL⁃2以维持T细胞活性。就此，本研究多种不同细胞因子表达的溶瘤病毒VVDS(VVDD⁃CCL5、VVDD⁃CxC11、VVDD⁃IL15Rα、VVDD⁃IL2），以增强抗肿瘤免疫反应，并将T细胞引入肿瘤组织。观察干预10d后的VVDD⁃CCL5、VVDD⁃CxC11、VVDD⁃IL15Rα、VVDD⁃IL2各组抗肿瘤免疫反应表达。发现注射生理盐水的对照肿瘤中，没有肿瘤反应T细胞。相比之下，每一个病毒治疗的肿瘤都显示出肿瘤反应性CD8+的显著增加。VVDD⁃IL 2组大鼠IFN⁃γ阳性斑点表达高于其他组别，因此选取VVDD⁃IL 2进行进一步研究。

肿瘤中的免疫细胞浸润影响肿瘤的进展和患者的生存，据报道，在包括结直肠癌在内的多种类型的癌症中，强淋巴细胞浸润与抗肿瘤反应和改善临床结果相关[11]。然而，大多数实体瘤，特别是那些低肿瘤突变负荷（TMB）的实体瘤，缺乏炎症浸润。癌症发展出免疫逃逸机制以避免效应免疫细胞的检测。这包括免疫系统检查点配体如PD⁃L1的细胞表面表达、可溶性免疫抑制因子如转化生长因子β、血管内皮生长因子、白细胞介素⁃10、半乳糖凝集素⁃1、吲哚胺2,3⁃脱氢酶的分泌、主要组织相容性复合体（MHC) I类表达下调，以及C⁃X⁃C趋化因子受体4型、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等受体的过表达[12-14]。免疫抑制性肿瘤微环境包括免疫抑制性巨噬细胞、髓源性抑制细胞和干扰有效抗肿瘤T细胞反应的调节性T细胞。抑制检查点分子如CTLA⁃4、PD⁃1、TIM⁃3、LAG3在慢性刺激的T细胞中上调，促进T细胞能量。OVs克服免疫抑制TME，将冷肿瘤变成“热”[15]。它们在体内感染并杀死肿瘤细胞，并诱导炎症反应，清除病毒和一些未感染的肿瘤细胞，尽管免疫抑制TME。病毒最终通过免疫从肿瘤中清除，并产生肿瘤反应性T细胞。这种局部细胞毒性和抗肿瘤免疫活性有限的全身活性。在足够的肿瘤感染的情况下，成功地全身递送OVs以对转移性肿瘤产生有意义的影响，仍然是一个挑战。利用局部抗肿瘤免疫进行全身治疗的一种方法是收获受感染的肿瘤组织，在体外分离和扩增肿瘤反应性T细胞，并将其过继地转移回患者体内。在Ribas等[15]的一项临床研究中，黑色素瘤患者瘤内注射Talimogene laherparepvec(FDA和EMA批准的第1种溶瘤病毒）可导致浸润性T细胞增加而不依赖于T细胞基线。本研究首次证明了使用这些TILs进行治疗的可行性。当分析TIL群体中的T细胞亚群时，VVDD治疗小鼠的TIL质量得到了很大改善。可提高Tcm和Tem细胞表达水平。此外，结果还显示VVDD⁃IL 2组CTLA⁃4、TIM⁃3表达高于对照组，PD1highTIM3+、Foxp3+CD4+表达低于对照组，证实VVDD⁃IL2进一步提高了治疗效果，减少Treg细胞耗尽。这可有效地扩展TILs和OV的效用。这种免疫疗法将针对每个患者的肿瘤新抗原进行个性化治疗，与CAR⁃T细胞相比，在抗原识别和免疫细胞类型方面将是多克隆的，减少对正常细胞产生反应（脱靶毒性）风险。

溶瘤病毒诱导的抗肿瘤免疫反应已被广泛研究。先前在动物模型中的耗竭研究表明，抗肿瘤反应和长期存活主要归功于CD8+T细胞，CD4+T细胞、NK细胞和中性粒细胞也有较小程度的作用。在目前的研究中发现VVDD⁃IL2表现最好，导致肿瘤反应性CD8+TILs水平最高。该病毒诱导了骨肿瘤细胞特异性T细胞反应，并且在没有该病毒的情况下注射细胞因子不能重复这种效果。细胞因子IL⁃2在20世纪90年代被批准用于治疗转移性黑色素瘤和肾癌。从那时起，已经测试了不同的应用策略和组合来克服毒性并实现特异性抗肿瘤免疫反应[16]。本研究首次证明了一种新的治疗方法⁃使用从实体瘤中分离的病毒诱导的TILs进行ACT治疗。免疫染色的数据证实，VVDD⁃IL2在肿瘤中吸引了大量的CD3+CD8+T细胞，并增加了特异性肿瘤反应性的百分比。从用VVDD⁃IL2治疗的肿瘤中分离出的这些TILs能够在培养中扩增并保持其活性和特异性。与同一肿瘤细胞共培养后，我们观察到CD8+和CD4+TILs的IFN⁃γ释放和4⁃1BB表达水平较高，证明了溶瘤病毒诱导的肿瘤反应性TILs的治疗功效原理。

病毒诱导的肿瘤反应性TILs此前尚未在ACT中进行治疗效果测试。在文献中，大多数关于TILs的研究都是通过培养肿瘤小块并扩大生长的T细胞在患者中进行的。小鼠TILs的分离是具有挑战性的，只有少数报道记录了小鼠TILs的培养。在小鼠系统中，大多数ACT研究都是使用来自脾细胞的T细胞进行的，并普遍使用超抗原（如抗cd3和CD28抗体）激活。许多研究人员已经在癌症模型中探索了OV与ACT的结合，使用病毒来改善过继转移细胞的运输，但不是作为“pre⁃TIL”方法来提高肿瘤反应性T细胞的恢复。小鼠TILs已通过磁珠或FACS分选从肿瘤组织来源的单细胞悬液中分离出来。本研究使用磁珠分选（CD90.2抗体）进行分离，小鼠TILs只有在与肿瘤组织明确分离的情况下才能在体外扩增。在体外短期扩增后检测它们的功能时，它们保留了肿瘤特异性。本研究中肿瘤特异性4⁃1BB在CD4+T细胞中表达增强。

综上所述，溶瘤病毒诱导下过继细胞疗法用于骨肿瘤治疗可延长大鼠生存时间，IL2武装溶瘤病毒可促进T细胞浸润，并提高肿瘤反应性TILS的数量。促进肿瘤反应性TILS在低或低免疫原性肿瘤中的生成和浸润，并扩大这种TILS用于细胞过继治疗可能是骨肿瘤治疗的新策略。

作者贡献声明李战鹏负责科研设计、数据分析整理以及文章撰写、修改；李斌负责实验手术指导及文章审阅；刘鹏飞负责实验实施、数据收集及协助文章审阅

利益冲突声明所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突，课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道

机构伦理问题研究方案经张家口市第一人民医院医学伦理委员会批准

参考文献:

[1]董婧,邹宏岩,陈静,等.调控纳米载体和肿瘤相关巨噬细胞用于肿瘤免疫治疗的研究进展[J].中国肿瘤,2021, 30(9):6.

[2]彭译漫,罗香梦,陈婧瑶.肿瘤微环境代谢的研究进展及免疫治疗新策略[J].四川大学学报(医学版),2023, 54(3):505.

[3]张青青,许莲蓉.肿瘤过继性细胞免疫治疗中CAR-T及TCR-T疗法研究进展[J].新医学,2021,52(3):165-169.

[6]林希,向莉苹,阳一,黄娜.溶瘤病毒在肺癌治疗中的研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志,2022,21(5):374-380.

[7]王磊,霍彬,霍小东.溶瘤病毒抗肿瘤治疗的临床应用进展[J].中国肿瘤临床,2021,48(11):581-586.

[8]胡祥华,郑瑞武.自噬基因Beclin1过表达骨肉瘤中Ki-67和P53的表达及相关性[J].解剖学研究,2020,42(1):72-75.

[9]林丽,张志华,王津晗,等.橘皮化合物5-ATAN诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡及其机制研究[J].解剖学研究,2023,45(4):337-341.

[11]陈李强,沈欣然,黄园.内质网靶向递药系统用于抗肿瘤免疫治疗的研究进展[J].药学学报,2022,57(1):76-84.

[12]胡乃华(编译).小檗碱通过抑制CSN5的脱泛素活性,减少肿瘤细胞PD-L1的表达,促进抗肿瘤免疫[J].天然产物研究与开发,2021,33(7):1146-1146.

[13] Chatterjee S, Azad BB, Nimmagadda S. The intricate role of CXCR4 in cancer[J]. Adv Cancer Res, 2015, 124:31-82.

[14]赵莉娅,赵铁铮,庞英,杨娜,范彦军.乐伐替尼对甲状腺癌SW579细胞放射敏感性及血管内皮生长因子､碱性成纤维细胞生长因子､碱性成纤维细胞生长因子受体表达的影响[J].陕西医学杂志,2023,52(8):956-959.

基金资助:张家口市科学技术研究与发展计划项目(1711042H);

文章来源:李战鹏,李斌,刘鹏飞.溶瘤病毒诱导下过继细胞疗法用于骨肿瘤治疗可行性研究[J].解剖学研究,2024,46(05):431-436.