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新疆沙枣叶提取物体内外抗肿瘤活性研究

2020-10-17 949 上传者：管理员

摘要：目的：评价新疆沙枣叶水提取物(EALs)体内外抗肿瘤活性。方法：采用MTT法测定EALs的体外抑瘤作用,计算半数抑制浓度(IC50)。通过建立S180荷瘤小鼠模型,观察不同浓度EALs对荷瘤小鼠肉瘤生长的抑制作用。采用ELISA法测定细胞因子IL-6和TNF-α的水平,HE染色观察肉瘤病理切片,探讨EALs对荷瘤小鼠免疫功能的影响。结果：EALs对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人慢性髓原白血病细胞K562、小鼠腹水瘤细胞S180、人非小细胞肺癌细胞A549、人组织细胞淋巴瘤细胞U937这6种常见的人肿瘤细胞均有抑制作用,其IC50值在95.123～303.427μg•mL-1。EALs对人乳腺癌细胞MCF-7抑制效果最好;EALs可明显抑制荷S180肉瘤小鼠模型肉瘤生长,能降低荷瘤小鼠血清细胞因子IL-6和TNF-α的水平,病理切片显示,中浓度EALs抑瘤效果较好。结论：EALs具有一定的体内外抗肿瘤活性,体外人乳腺癌细胞MCF-7对其最为敏感,体内抑制效果以中浓度最佳,其作用机制可能与促进免疫功能有关。

关键词：
抗肿瘤
沙枣叶
瘤鼠
肿瘤细胞
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沙枣属胡颓子科胡颓子属植物,别名银柳、香柳、七里香和桂香柳等。广泛分布于干旱寒冷的亚洲、欧洲的温带地区和北美洲的部分地区[1]。沙枣被誉为盐碱地、沙荒的“宝树”,其枝、叶、花、果都具有较高的经济价值[2]。《中草药大典》[3]记载沙枣叶为胡颓子科植物沙枣的叶,味辛涩、性凉,有清热解毒、抗菌消炎、活血止血的功效,用于细菌性痢疾、肠炎腹泻、慢性支气管炎、冠心病等,用量为15～30g。

新疆沙枣叶中成分复杂[4,5,6]。文献报道沙枣水提物对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖有降低作用[7],沙枣提取物具有一定的抗肿瘤作用[8],但是关于沙枣叶抗肿瘤活性的研究较少。本实验对新疆沙枣叶水提取物(EALs)的体外抗肿瘤活性及荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用进行了研究,旨在为进一步开发沙枣叶抗肿瘤作用提供科学的实验依据。

1、材料

1.1仪器

CJ-1F型医用净化工作台(苏州冯氏实验动物设备有限公司);台式低速离心机(湖南省凯达实业发展有限公司);DMIL型倒置显微镜(Leica);3111型CO2培养箱(Thermo);MR-96A酶标仪(深圳迈瑞);无菌针式过滤器(Millipore);FlexStation3多功能酶标仪(MolecularDevices);ICV-450电热恒温培养箱(日本ASONE)。

1.2试药

高糖DMEM培养基(HyClone公司,批号:AAM210569);胎牛血清(ScienCell公司,批号:M048-6);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司,批号:MKBH7489V);二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司,批号:20140612);胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限公司,批号:04D10151)。小鼠TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(批号:E-EL-M0049c)、小鼠IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒(批号:E-EL-M0044c)(伊莱瑞特公司)。顺铂(DDP,东京化成工业株式会社,批号:D3371)。5-氟尿嘧啶(Amresco公司,批号:HFBM160120325008)。注射用环磷酰胺(江苏盛迪医药有限公司,批号:32020857)。

沙枣叶于2016年6-8月采摘于新疆乌鲁木齐市鲤鱼山,将新鲜采摘的沙枣叶平铺于干净、通风、无阳光直射的房间中,隔天将沙枣叶翻面,自然阴干即得。经新疆维吾尔自治区中医医院李永和主任药师鉴定为胡颓子科植物沙枣(ElaeagnusangustifoliaL.)的干燥叶。密封,置阴凉处保存。

1.3细胞株和实验动物

人乳腺癌细胞MCF-7、人非小细胞肺癌细胞A549、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人结肠癌细胞LoVo、人肝癌细胞HepG2、人慢性髓原白血病细胞K562、人组织细胞淋巴瘤细胞U937、小鼠腹水瘤细胞S180(中科院细胞库)。

ICR小鼠,雄性,体质量(20±2)g[新疆医科大学实验动物中心,实验动物许可证SYXK(新)2016-0002]。

2、方法

2.1新疆沙枣树叶水提取物制备[6]

称取100g干燥沙枣叶,于烧杯中石油醚(60～90℃)浸泡过夜,将沙枣叶晾干后,乙酸乙酯连续回流提取直至颜色几乎透明;再将沙枣叶晾干后,正丁醇连续回流提取;待叶子完全干透,加水回流提取2次,合并滤液浓缩干燥得EALs,提取率为12.72%,备用。

2.2细胞株与培养条件

将8种不同肿瘤细胞株分别培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中,在37℃、5%CO2的饱和湿度环境下常规培养。传代时除细胞株K562、U937外均用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化5min后吸弃消化液,加细胞培养基轻轻吹打成均匀细胞悬液,培养至对数生长期备用。

2.3体外抗肿瘤活性测定[9,10]

取对数期生长的MCF-7、A549、SK-OV-3、LoVo、HepG2、K562、U937、S180细胞,以每孔2×104个·mL-1密度接种于96孔细胞培养板中,培养12h待细胞贴壁后,设置正常对照组、阳性对照药(DDP)组、EALs组(600、200、60、20、6μg·mL-1),每组3个复孔。正常对照组以完全培养液孵育细胞,EALS组分别以含终浓度为600、200、60、20、6μg·mL-1药物的完全培养液孵育细胞,DDP组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μmol·L-1药物的完全培养液孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞48h后,每孔加MTT溶液(培养基配成5mg·mL-1,过滤后避光保存)20μL,4h后将上清液吸出,每孔加DMSO150μL,震荡待甲瓒完全溶解,酶标仪492nm测定OD值。以正常对照组OD值为100%细胞活力,其余各组OD值与正常对照组OD值的比值为相对活力。以相对活力评价样品对上述8种细胞的毒性。采用SPSS21.0统计软件对数据进行处理,采用Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)。

2.4对S180移植瘤生长的影响

参照文献方法[11],复苏S180瘤株,每只小鼠腹腔注射0.4mLS180体内传代,无菌条件下抽取传第3代后接种7d的S180瘤源小鼠的腹水(黄色清亮液体),1000r·min-1离心5min后弃去上清液,无菌生理盐水调至细胞浓度为1×107个·mL-1,每只小鼠右腋部皮下接种0.2mL。次日将接种荷瘤小鼠随机分为模型组,阳性对照组[环磷酰胺(CTX):30mg·kg-1],EALs低、中、高剂量组(20、40和80g·kg-1)。阳性对照组每48h腹腔注射(ip)CTX0.3mL/只。其余各组均为灌胃(ig)给药,EALs每日灌胃0.2mL/10g,空白对照组及模型组给予等体积纯水,连续给药14d。期间观察各组小鼠肿瘤形成、生长发育情况和精神状态。

小鼠末次给药前禁食不禁水16h,末次给药后1h单侧摘眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠,解剖并剥离肿瘤组织,称重,计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型组小鼠平均瘤质量-给药组小鼠平均瘤质量)/模型组小鼠平均瘤质量×100%。

2.5ELISA法测定细胞因子[12]

取小鼠全血离心,取血清放于-80℃备用。临用前平衡至室温,按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作,测定细胞因子TNF-α和IL-6的水平。

2.6HE染色观察荷瘤小鼠肿瘤组织形态表现[13]

将所取小鼠肿瘤组织固定于10%的中性福尔马林溶液中,常规脱水石蜡包埋,切成4μm薄片,HE染色,于光学显微镜下观察肿瘤组织病理形态。

2.7统计学处理

采用SPSS21.0统计软件进行单因素方差分析及组间两两比较,计量资料以(x¯±s)表示,各组间样本均数比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1沙枣叶水提取物体外抗肿瘤作用筛选

由表1可知,EALs对6种人肿瘤细胞MCF-7、A549、HepG2、K562、U937、S180的体外IC50值在95.123～303.427μg·mL-1,其中MCF-7细胞的IC50值最小,即为95.123μg·mL-1。EALs对LoVo和SK-OV-3细胞不但无抑制作用,还而有促进增殖作用。

3.2对S180移植瘤生长的抑制作用

EALs各剂量组均能够明显抑制S180肿瘤的生长,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。EALs各组给药后,动物体质量均有不同程度的增加,EALs低浓度组体质量显著增加,与对照组和模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表1EALs对8种人肿瘤细胞的IC50值

表2EALs对S180荷瘤小鼠的影响(n=8,x±s)

3.4S180荷瘤小鼠血清细胞因子测定

与空白对照组比较,模型组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,EALs各浓度组小鼠血清中TNF-α明显降低、中浓度组IL-6的水平明显降低(P<0.05),具体结果见表3。

4、讨论

在本研究中,采用抗肿瘤药物筛选常用的MTT法,以DDP为阳性对照,基于常见的8种人肿瘤细胞MCF-7、A549、SK-OV-3、LoVo、HepG2、K562、U937、S180考察EALs的抗肿瘤活性,结果发现EALs对除SK-OV-3、LoVo外的另6种人肿瘤细胞均有生长抑制作用。其中对人乳腺癌细胞MCF-7抑制作用最强,考虑到S180肿瘤模型造模简便,成本较低,具有普遍代表性,故选择其进行后续研究。

表3各组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平(n=5,x±s)

体内抑瘤实验结果表明,在20、40g·kg-1时EALs对小鼠S180移植性肿瘤有一定的抑制作用,抑瘤率分别为25.95%、30.00%,还能提高荷瘤小鼠的体重,一般状态良好,说明EALs对正常机体影响较小,无明显不良反应。

本课题组前期研究发现,新疆沙枣树叶的特征元素为Mg、Al、Fe、Cu、Cd、K、Se[14]。同时新疆沙枣叶中含有多肽、蛋白质、有机酸、酚类、鞣质、皂苷、黄酮、甾体、三萜类等成分,本课题组测定过沙枣叶中3种有机酸,即鞣花酸、没食子酸和阿魏酸,3种有机酸的含量约为0.590mg·g-1[15]。文献报道,沙枣树叶含有蛋白质、脂肪、糖类及17种氨基酸,氨基酸中有8种是动物不能合成的[16],苏氨酸、缬氨酸的含量超过0.7%,亮氨酸超过1.5%。可知,沙枣树叶具有丰富的化学成分和营养价值。因此,在本实验中,给药组的小鼠体质量的增长较为明显。同体积下,EALs低、中浓度药物溶液分散性较好,有利于动物的吸收。低浓度给药组的动物体质量增长最多,与提取物丰富的化学成分和营养物质有关,还可能与动物自身的生长和瘤体增加有关。高浓度给药组可能由于分散性较差,在小鼠灌胃过程中溶液黏稠不易服用,同时药物的有效成分和营养物质不能充分的溶出,导致小鼠体质量没有明显的变化。相对而言,中浓度给药组最佳,保持了良好的抑瘤作用,还能促进动物机体的增长。这也提示后期设计给药剂型可以考虑制备液体剂型,以有利于药物成分的溶出,促进机体的吸收。

中药提取物成分较为复杂,药物在体内的吸收受到多种因素的影响,多组分多靶点协同起效是中药作用特点。体内药物作用的靶点、受体饱和度等因素均可影响药物在体内的作用。中药较单一化合物而言,其量效关系较难确定。相信随着沙枣叶化学成分的进一步明确,可以准确地揭示沙枣叶抗肿瘤作用的量效关系及机制。

沙枣作为西北常见的药用植物之一,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用[8]。目前,对于沙枣的研究主要集中在果实,对沙枣叶的研究较少,关于其抗肿瘤活性的药效学研究并不明确。本研究为今后新疆沙枣叶抗肿瘤活性研究提供了理论参考,然而,其抗肿瘤的药效成分物质基础及其机制等方面仍有待进一步的研究。

参考文献：

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[2]新疆生物土壤沙漠研究所编.新疆药用植物志.第2册[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社,1981,761.

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[6]夏米斯巴奴·艾则孜,巴依尔太,孙芸.新疆沙枣叶的鉴别与化学成分初步研究[J].新疆医科大学学报,2019,42(4):529-532,540.

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