结肠癌具有发病率高及易复发转移的特点，临床治愈率很低[1]。免疫细胞的增殖与肿瘤浸润是抗肿瘤免疫的重要基础[2]。环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthas, cGAS)/干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)与双链DNA结合后可激活不同的免疫反应[3]。益母草碱为益母草中含有的生物碱类成分，于肉仔鸡日粮中添加益母草碱可改善其免疫功能[4],因此推测益母草碱可能对抗肿瘤免疫功能具有改善作用并可用于治疗结肠癌。本研究旨在探究益母草碱调节cGAS-STING信号对肿瘤生长和免疫功能的影响。

一、材料与方法

1 材料

动物

雌性SPF级C57BL/6小鼠，鼠龄7周，体质量21～26 g,购自武汉有度生物科技有限公司。动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0025。本研究经中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院伦理委员会批准[伦理批号：伦审2022-041(科)-01]。

细胞株

小鼠结肠癌细胞系MC38,购自南京科佰生物科技有限公司。

药品与试剂

益母草碱，规格：每瓶20 mg;纯度：>98.5%;批号：111823-201704,购自中国食品药品检定研究院。空载质粒、cGAS siRNA质粒，均购自汉恒生物；小鼠白细胞介素(interleukin, IL)-2酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒、小鼠IL-12 ELISA试剂盒、小鼠γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)ELISA试剂盒，均购自武汉赛培生物科技有限公司；兔抗小鼠cGAS、STING、CD8、CD4一抗，均购自美国CST公司等。

仪器

MA6000实时荧光核酸定量检测聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，广东正一实验装备有限公司产品；BM-14DF生物光学显微镜，购自青岛明博环保科技有限公司；YP-96全自动酶标仪，山东优云谱光电科技有限公司。

2 实验方法

2.1 模型构建[5]5]

MC38细胞计数后制备密度为1×107 cell·mL-1的细胞悬液，于C57BL /6雌性小鼠右腿皮下注射0.2 mL造模，7 d后观察成瘤情况。

2.2 动物分组与处理方法

于造模7 d后分组处理小鼠，低、高剂量实验组小鼠分别灌胃180和360 ng·g-1益母草碱，同时尾静脉注射与高剂量+cGAS敲低组等剂量的0.9% NaCl(每周2次);高剂量+空载组、高剂量+cGAS敲低组小鼠均灌胃360 ng·g-1益母草碱，同时分别尾静脉注射空载质粒、cGAS siRNA质粒(空载质粒、cGAS siRNA质粒溶于0.9% NaCl, 1.2 nmol·20 g-1,50μL,每周2次);对照组小鼠灌胃10μL·g-1 0.9% NaCl, qd,同时尾静脉注射与高剂量+cGAS敲低组等体积的0.9% NaCl(每周2次),各组小鼠均连续处理2周。

2.3 结肠癌小鼠肿瘤体积、质量的测定及标本采集

首次给药前(记为第0天)测定各组小鼠肿瘤长径与短径后计算其体积，公式：体积=(长径×短径2)/2,每隔2 d测量1次，直至第21天给药处理结束，按照参考文献[8]的方法采集样品及提取CD4+和CD8+T细胞。

2.4 实时荧光定量PCR法检测各组小鼠肿瘤组织cGAS-STING信号通路的表达情况[7]7]

小鼠肿瘤组织加入适量Trizol研碎，按其试剂说明书的要求提取总RNA,然后通过一步法进行实时荧光定量PCR反应，用β-actin做内参基因，用2-ΔΔCt法计算各组cGAS、STING基因相对表达水平。

2.5 免疫组化染色检测各组小鼠肿瘤组织cGAS-STING信号通路表达及肿瘤T淋巴细胞浸润[5]5]

小鼠肿瘤组织切片行脱蜡、分级水化、抗原修复后，依次孵育3%过氧化氢、5%牛血清白蛋白、一抗，洗片后孵育相应二抗并行DAB显色，具体操作按兔SP免疫组织化学试剂盒说明书的要求进行，用Image J软件定量各组cGAS和STING阳性表达的平均光密度后，计算其相对阳性表达。

2.6 ELISA法测定各组小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-2水平[8]8]

取“2.3”中的各组小鼠血清以冰水浴解冻后每组取0.2 mL,用ELISA法测定其中IFN-γ、IL-12、IL-2水平，具体操作按各自ELISA试剂盒说明书的要求进行。

2.7 细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖能力[5]5]

小鼠脾淋巴细胞传代后计数，调整细胞密度为3×106 cell·mL-1,接种在96孔培养板内，每孔接种100μL,每组的各样本设刺激孔及对照孔，刺激孔加入含20μg·mL-1刀豆素A的DMEM培养基100μL用于刺激T细胞活化增殖，对照孔加入DMEM培养基100μL,培养48 h后每孔加入CCK-8试剂20μL继续培养3 h,按各自CCK-8试剂盒说明书的要求测出每组刺激孔及对照孔的平均光密度后计算其刺激指数。

2.8 CCK-8实验检测小鼠脾T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤率[5]5]

MC38细胞及各组小鼠脾CD4+和CD8+T细胞，传代后计数，将各组T淋巴细胞与MC38细胞以5∶1的有效靶比于96孔板中共培养，48 h后吸出悬浮生长的CD4+和CD8+T细胞，以CCK-8法测定各组贴壁生长的MC38细胞光密度后计算其杀伤率。杀伤率=(1-实验组光密度/对照组光密度)×100%。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以表示，用单因素方差分析进行多组间差异比较，两两之间进一步差异比较行SNK-q检验。

二、结 果

1 各组小鼠肿瘤生长情况的比较

对照组给予0.9% NaCl;低剂量实验组给予180 ng·g-1益母草碱；高剂量实验组给予360 ng·g-1益母草碱；高剂量+空载组给予360 ng·g-1益母草碱+空载质粒；高剂量+cGAS敲低组给予360 ng·g-1+cGAS siRNA质粒。

对照组、低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组和高剂量+cGAS敲低组小鼠给药21 d后的肿瘤体积分别为(1 088.32±70.82)、(715.45±22.59)、(468.20±24.28)、(480.01±23.78)和(998.99±32.84)mm3,肿瘤质量分别为(0.70±0.12)、(0.43±0.07)、(0.21±0.05)、(0.22±0.06)和(0.65±0.09)g。与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠给药21 d后肿瘤体积与质量均显著降低(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠给药21 d后肿瘤体积与质量均显著降低(均P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+空载组小鼠给药21 d后肿瘤体积与质量无明显变化(均P>0.05),高剂量+cGAS敲低组小鼠给药21 d后肿瘤体积与质量均显著升高(均P<0.05)。

2 各组小鼠肿瘤cGAS-STING信号通路表达的比较

对照组、低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组、高剂量+cGAS敲低组小鼠的cGAS mRNA相对表达水平分别为1.02±0.16、1.90±0.15、2.73±0.19、2.75±0.17和1.07±0.14,STING mRNA相对表达水平分别为1.04±0.19、1.81±0.20、2.57±0.26、2.60±0.18和1.10±0.17,cGAS相对阳性表达分别为1.00±0.00、2.64±0.51、5.18±0.73、5.30±0.80和1.12±0.46,STING相对阳性表达分别为1.00±0.00、2.70±0.47、5.64±0.81、5.48±0.75和1.14±0.50。与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠肿瘤组织cGAS与STING mRNA、cGAS与STING相对阳性表达均显著升高(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠肿瘤组织cGAS与STING mRNA、cGAS与STING相对阳性表达均显著升高(均P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+空载组小鼠肿瘤组织cGAS与STING mRNA、cGAS与STING相对阳性表达水平在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05);高剂量+cGAS敲低组小鼠肿瘤组织cGAS与STING mRNA、cGAS与STING相对阳性表达均显著降低(均P<0.05)。结果见图1。

图1用免疫组化染色检测各组小鼠肿瘤环状GMP-AMP合成酶/干扰素基因刺激因子(cGAS-STING)通路相关蛋白的表达情况(×200)   

3 各组小鼠肿瘤T淋巴细胞浸润情况的比较

对照组、低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组、高剂量+cGAS敲低组小鼠的CD4+T阳性细胞数分别为(40.25±5.82)、(76.32±8.20)、(118.64±15.30)、(113.25±16.65)和(48.74±7.10)个，CD8+T阳性细胞数分别为(49.76±6.12)、(93.80±10.45)、(143.68±16.80)、(135.75±17.42)和(57.01±8.24)个。与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠肿瘤组织CD4+T与CD8+T阳性细胞数均显著升高(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠肿瘤组织CD4+T与CD8+T阳性细胞数均显著升高(均P<0.05);高剂量+空载组小鼠肿瘤组织CD4+T与CD8+T阳性细胞与高剂量实验组比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),高剂量+cGAS敲低组小鼠肿瘤组织CD4+T与CD8+T阳性细胞数与高剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

4 各组小鼠血清免疫细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-2水平的比较

与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-2水平均显著升高(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-2水平均显著升高(均P<0.05);高剂量+空载组小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-2水平与高剂量实验组比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),高剂量+cGAS敲低组小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-2水平与高剂量实验组比较均显著降低(均P<0.05),见表1。

5 各组小鼠脾淋巴细胞增殖能力的比较

对照组、低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组、高剂量+cGAS敲低组的刺激指数分别为0.76±0.05、0.92±0.07、1.12±0.10、1.14±0.09和0.78±0.06。与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组的刺激指数均显著升高(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组、高剂量+空载组的刺激指数均显著升高(均P<0.05);高剂量+空载组的刺激指数与高剂量实验组比较，在统计学上差异无统计学意义(P>0.05),高剂量+cGAS敲低组与高剂量实验组比较，刺激指数显著降低(P<0.05)。

表1各组小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-12、IL-2水平的比较

6 各组小鼠脾T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤率的比较

对照组、低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组、高剂量+cGAS敲低组的CD4+T细胞对肿瘤细胞杀伤率分别为(13.02±2.62)%、(31.75±3.57)%、(52.14±6.39)%、(47.02±7.01)%和(17.41±3.68)%,CD8+T细胞对肿瘤细胞杀伤率分别为(17.13±3.05)%、(36.32±4.39)%、(57.10±7.42)%、(52.48±6.57)%和(21.64±3.84)%。与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠CD4+与CD8+T细胞对肿瘤细胞杀伤率均显著升高(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组、高剂量+空载组小鼠CD4+与CD8+T细胞对肿瘤细胞杀伤率均显著升高(均P<0.05);与高剂量实验组比较，高剂量+空载组小鼠CD4+与CD8+T细胞对肿瘤细胞杀伤率均无显著性变化(均P>0.05),高剂量+cGAS敲低组小鼠CD4+与CD8+T细胞对肿瘤细胞杀伤率均显著降低(均P<0.05)。

三、讨 论

中草药及其活性成分在恶性肿瘤的治疗中得到了广泛应用，具有药物不良反应小、安全性高的优点。益母草碱作为益母草的主要有效成分之一，可抑制宫颈癌细胞增殖与克隆形成并促进其凋亡[9]。本研究结果显示，以益母草碱处理结肠癌荷瘤小鼠模型可升高小鼠肿瘤组织CD4+T与CD8+T阳性细胞数，CD4+与CD8+T细胞对结肠癌细胞杀伤率，血清IFN-γ、IL-12及IL-2水平、刺激指数，并降低小鼠21 d肿瘤体积与质量，表明益母草碱可提升淋巴细胞的细胞增殖能力，从而抑制肿瘤浸润能力。

cGAS作为双链DNA的细胞质传感器，可结合STING通过激活免疫效应在抗肿瘤免疫中发挥重要作用[3],上调cGAS和STING表达可使结肠癌细胞周期停滞并抑制其增殖，增加肿瘤微环境中免疫细胞量，进而抑制结肠癌体内肿瘤生长[10]。本研究结果显示，以益母草碱处理结肠癌荷瘤小鼠，可增强其cGAS与STING表达，表明cGAS-STING参与介导益母草碱对结肠癌荷瘤小鼠免疫功能的改善及对肿瘤生长的抑制过程。以益母草碱和cGAS siRNA质粒联合处理结肠癌荷瘤小鼠，相比益母草碱单独处理，可减弱小鼠cGAS与STING表达，并降低其肿瘤组织CD4+T与CD8+T阳性细胞数、CD4+与CD8+T细胞对结肠癌细胞杀伤率。以上结果表明，敲低cGAS可减弱益母草碱对淋巴细胞细胞增殖的促进作用，减弱其对小鼠免疫细胞因子合成分泌及对CD4+与CD8+T淋巴细胞肿瘤杀伤力的增强作用，消除其对结肠癌荷瘤小鼠免疫功能的改善及对肿瘤生长的抑制作用，最终逆转益母草碱对结肠癌的抗癌功效。

参考文献:

[4]乔彦杰,杨莉,刘晓婷,等.益母草碱对肉仔鸡生长性能,免疫功能和肠道菌群的影响[J].家畜生态学报,2019,40(5):34-38.

[5]成敏蓉,刘杭丰,高书华,等.唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15促进结直肠癌细胞增殖和迁移并抑制肿瘤组织中CD4+与CD8+ T细胞浸润[J].中国生物化学与分子生物学报,2022,38(5):621-629.

[9]罗娜,杨启.益母草碱调控LINC00461抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的实验研究[J].中国药物应用与监测,2022,19(5):299-302.

基金资助:国家卫生健康委“十四五”规划全国重点课题基金资助项目(YYWS2810);

文章来源:刘建邦,黄娟,李斌.益母草碱对结肠癌荷瘤小鼠肿瘤生长和免疫功能的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):398-402.