肿瘤的发生严重影响人类健康，因其最主要的特点是细胞生长失控和肿瘤细胞转移，已成为全球引起死亡的重要原因之一。目前肿瘤的治疗方法主要有传统的手术治疗、放射治疗、化学治疗和近年来发展迅速的靶向治疗和免疫治疗等新型治疗方式，而肿瘤热疗因其相比于这些疗法具有无创、无痛、安全、舒适的优势，越来越受关注。目前，热疗既可与放疗、化疗等方案联用，改变肿瘤生理状态，提高化疗和放疗的疗效[1]，也可以作为不宜接受其它治疗方案的患者的姑息治疗手段。已有报道，在治疗肿瘤时，用RT和热疗联合应用的成功案例，如乳腺癌[2]、宫颈癌[3]等。

热疗对细胞增殖和死亡的影响表明其明显抑制细胞的增殖，可以看到细胞死亡明显增加[4]。研究表明，当温度达到42.5℃以上时，细胞的生存率会急剧下降[5]。加热后细胞凋亡可能是由轻度膜变化引起的胞质钙水平有限增加或DNA损伤引起的[6,7]，另外，DNA损伤应答和修复在细胞增殖、癌症发生和癌症治疗中起着决定性作用。DNA受到损伤后，大量的DNA损伤应答因子以协调有序的方式聚集到损伤位点，对损伤进行修复。所以，癌细胞会自行修复抗癌药物引起的DNA损伤，而加热能阻止癌细胞的自我修复，但是，其中的机制还未完全阐明。

细胞凋亡属诱发行为，诱因很多，如DNA损伤、生长因子撤除、FasL及TNF作用、糖皮质激素作用、细胞间接触等[8]。在整个细胞凋亡过程中，caspase家族即半胱氨酸蛋白酶起着不可或缺的作用，我们称之为凋亡蛋白酶，细胞凋亡的过程实际上是caspase不可逆地有限水解底物的级联放大反应过程[9]。Caspases是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡信号传导的级联反应中起协同作用。当细胞接收到外源性信号刺激后，激活细胞膜表面的死亡受体，经肿瘤坏死因子(TNF)或者FAS(一种跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子受体超家族成员)系统启动caspase的级联活化，使细胞发生凋亡，凋亡细胞的特征性表现有，DNA裂解成200bp左右的片段，染色质固缩，细胞膜活化，细胞皱缩，形成由细胞膜包裹的凋亡小体，最后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。例如Caspase-8作为外源性凋亡的起始caspase，可诱导细胞凋亡[10]。

另外，泛素化的多样性涉及各种生理过程，包括细胞的增殖、凋亡、自噬、内吞、DNA损伤修复及免疫应答等。在哺乳动物细胞中已经观察到许多不同种类的具有不同生物学功能的泛素链。其中，K29和K48连接的多聚泛素化导致蛋白酶体介导的底物蛋白降解[11,12]，而通过K63连接的多聚泛素化修饰的底物蛋白被特定的调节因子识别，触发相应的信号通路[13]。K63连接的多泛素化修饰，主要作用是信号传导及DNA损伤反应的调节[14,15]。据报道，Cullin-3与DISC相互作用，它促进K63连接的p10亚基泛素化caspase-8，然后将活性caspase-8募集到富含泛素的病灶中，从而增强其酶活性和诱导细胞凋亡[16]。

在本文中，我们对热疗和化疗联合应用激活caspase及抑制肝癌细胞DNA损伤修复来诱导细胞凋亡的潜在机制进行研究，为临床实践中实施热疗与化疗联合治疗癌症提供了理论支持。

1、材料和方法

1.1 细胞培养

HepG2细胞购自Procell，培养在添加了10%胎牛血清(FBS,ExCell Bio,FSP500)、0.25%(0.5 mM) l-谷氨酰胺(Gibco,25030-081)、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100µg/mL)(Sangon Biotech,E607011-0500)的高糖DMEM (Basal Media,L110KJ)基础培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.2 抗体和试剂

1.2.1 一抗

DNA-PKcs(3H6) Mouse m Ab(12311S)、Ku80 Rabbit Antibody(2753)、Caspase-3(rabbit;9662s)、Anti-CUL3(rabbit;10450s)购买自Cell Signaling Technology;HRP-conjugated GAPDH Mouse Monoclonal antibody(HRP-60004)购买自Proteintech;Caspase-8(rabbit;AF1650)购买自R&D Systems;Mouse-anti-caspase-8(1.1.40)(sc-81656)购买自Santa cruz;Tubulin(mouse;TA503129)购买自ORIGENE;Anti-K63-linked ubiquitin(rabbit;MA5-32573)购买自Invitrogen。

1.2.2 二抗

HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Antibody (K1221)、HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Antibody (K1223)购买自APExBIO。

1.2.3 试剂

CDDP(S1166)购买自Selleck;0.25%Trypsin-EDTA(25200-072)购买自Gibco。

1.3 Western blot(WB)蛋白质免疫印迹试验

收集细胞，加入裂解缓冲液(1%triton X-100,20 mM Hepes(pH 7.4),150 mM NaCl,12.5 mM β-glycerol phosphate disodium salt,1.5 mM MgCl2,2 mM EGTA)，并添加磷酸酶抑制剂混合物(APExBio,K1015-A,K1015-B)和蛋白酶抑制剂混合物(APExBio,K1007)裂解细胞。裂解物在4℃下13200 rpm离心15 min。收集上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度。上清液在1×上样缓冲液中，95℃煮沸10 min。取每个样品25µg蛋白通过SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜(Millipore,IPVH00010)上。将膜与一抗在4℃下孵育过夜，然后与HRP偶联的二抗孵育，并用ECL试剂盒(BOSTER,AR1174)可视化。

蛋白浓度测定Bradford溶液配制：称取考马斯亮蓝G-250100 mg，加入50 mL 95%乙醇，100 mL的85%H3PO4充分溶解，加ddH2O定容至1 L，室温保存。

1.4 DNA Smear的抽提及电泳

接种HepG2细胞2×106个到10 cm培养皿中，培养至70%～80%的细胞密度，进行给药CDDP(10µg/mL)、UVB(2 min)及加热处理后，用胰酶消化，500×g、5 min、4℃条件下离心，收集细胞，用预冷的1×PBS洗两遍后，1500 rpm、5 min、4℃离心，弃去1×PBS，向收集的细胞中加入0.5 mL细胞裂解液，充分吹打混匀后，37℃或50℃水浴中过夜。

向已过夜的反应体系中加入等体积pH8.0的苯酚∶氯仿(1∶1)，颠倒混匀，10000 rpm、10 min、4℃离心，静置20～30 min，以避免吸出蛋白质。吸取上层水相，再用等体积pH 8.0的苯酚∶氯仿(1∶1)重复抽提一次。吸取上层水相，用等体积的氯仿，颠倒混匀，10000 rpm、10 min、4℃离心，抽提一次。然后吸取上层水相，加入1/10体积的3 M NaAC和2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，放-20℃过夜。

将已过夜的反应体系在12000 rpm、4℃离心60 min，弃去液体，沉淀用1 mL 75%乙醇洗一次，在12000 rpm、4℃离心30 min，弃去液体，将沉淀干燥2 min后重悬于含有Rnase(200µg/mL)的TE buffer中，测定DNA浓度，取15µg进行0.5%琼脂糖凝胶电泳(80 V,1 h 15 min)。在显影仪中观察所得结果条带。

1.5 CCK-8

将细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板中，并在37℃、5%CO2培养箱中孵育过夜。用不同的诱导方法处理细胞4 h。每孔加入10µL CCK-8溶液，37℃孵育1～2 h后，在酶标仪(TECAN、SPARK)上测定450 nm(参比波长620 nm)处的吸光度。

1.6 细胞凋亡分析

采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒Ⅰ(BD Biosciences,556547)分析细胞凋亡情况。用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，加入完全培养液终止消化。收集细胞沉淀，用预冷的1×PBS洗涤，重悬在1×binding缓冲液中至1×106个细胞/mL，在100μL重悬的细胞溶液(1×105细胞)中加入4µL的Annexin V-FITC和5µL的PI染色缓冲液，并在黑暗中室温孵育15分钟。然后在每个样品中加入400µL的1×binding缓冲液，立即用流式细胞仪(BD FACSCalibur,USA)分析细胞。

1.7 Co-IP(泛素化)

将100 mm培养皿中的贴壁细胞用预冷PBS洗涤2次，刮下培养皿中的细胞。将其转移至1.5 m L离心管中，4℃下3000 rpm离心10 min。将沉淀重悬于300µL CO-IP缓冲液(裂解液添加10 mM Na F、1 mM Na3VO4、1 mM PMSF、10 mM NEM和20µM PI)中，冰上放置30 min，充分裂解。裂解液在4℃下13200 rpm离心15 min。取450µL裂解液，加入1.0µg mouse-anti-Caspase-8抗体，置于旋转仪(Kylin-Bel,QB-128)上4℃孵育约2 h。在每个免疫复合物中加入30µL预清洗的蛋白A/G磁珠(Beyotime,P2108)，在旋转仪上RT孵育2 h。蛋白A/G磁珠采用手动磁珠分离器收集，并进行洗涤。将收集的免疫复合物在2×上样缓冲液中95℃煮沸10 min，用8%SDS-PAGE进行Western blotting分析。

1.8 数据分析与统计学处理

使用Photoshop 2020软件对免疫印迹原始条带图进行处理，并使用image J软件对蛋白免疫印迹数据进行量化。实验所得数据采用Graphpad Prism 8.3.0软件进行统计学分析，数据表示为平均值±标准偏差(SD)。所有实验重复三次独立重复实验，采用one-way ANOVA分析或独立样本t检验来评估两组之间的差异。P≤0.05的差异被认为具有统计学意义；P<0.01的那些被认为是有显著统计学差异，(注：“**”表示P<0.01；“***”表示P<0.001；“****”表示P<0.0001)。

2、结果

2.1 实验条件筛选

图1 HepG2细胞在不同处理条件下caspase-8表达情况(左图WB、右图定量)  

Caspase-8作为外源性凋亡的起始caspase，在诱导细胞凋亡方面尤其重要，当其积累越多时细胞凋亡越严重。对机体加热时，癌变组织的温度可达到41.5～43.5℃并持续1～2 h，在这样的条件下，可促进癌细胞凋亡，使癌变组织遭到破坏。因此基于caspase-8的积累进行肝癌细胞热疗与化疗联合应用的条件筛选。

HepG2细胞分别在43℃下加热处理0 min、15 min、30 min、1 h，同时进行CDDP(10µg/mL)给药处理，(图1，左图)中WB结果显示，与0 min对照组相比，当加热时间达1 h后，caspase-8蛋白表达显著增加。(图1，右图)将蛋白免疫印迹数据进行灰度值量化后，43℃(1 h)+CDDP组Caspase-8相对于Tubulin表达量最多。综上所述，HepG2细胞热疗与化疗联合应用最佳处理条件为43℃加热1 h并给药CDDP(10µg/mL)。

2.2 热疗与化疗联合应用促进Caspase-8通过泛素化积累

由于泛素化的多样性涉及各种生理过程，包括细胞的增殖、凋亡、自噬、内吞、DNA损伤修复及免疫应答等。为进一步探究热疗与化疗联合应用促进caspase-8积累的原因，我们通过caspase-8免疫沉淀和沉淀物中泛素的检测来研究caspase-8的泛素化。(图2)联合应用使K63、CUL3蛋白表达增加，表明CUL3作为E3连接酶与caspase-8通过K63连接泛素化积累有关。

图2 Caspase-8免疫共沉淀  

2.3 热疗与化疗联合应用促进caspase-8积累诱导肝癌细胞凋亡

根据所筛选的条件对HepG2细胞进行处理后，采用Western blotting检测凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达和活化，(图3，左图)结果显示，HepG2细胞中caspase-8蛋白积累和caspase-3活化显著增加，(图3，右图)CCK-8结果显示细胞活力显著降低；(图4)通过流式细胞术检测得出细胞早期和晚期凋亡增加(图C:Q1象限代表坏死细胞、Q2象限是晚期凋亡细胞、Q3象限是早期凋亡细胞、Q4象限是未发生凋亡的细胞)，且具有显著统计学意义(P<0.01)。综上所述，热疗与化疗联合应用后促进caspase-8积累诱导HepG2肝癌细胞凋亡(UVB作为阳性对照)[17,18]。

图3 HepG2细胞在联合应用下的caspase表达(左)和细胞活力(右)   

图4 流式细胞术分析   

2.4 热疗与化疗联合应用对DNA损伤的影响

当细胞接收到外源性信号刺激后，激活细胞膜表面的死亡受体，启动caspase的级联活化，使细胞发生凋亡，其中特征性表现有DNA裂解成200 bp左右的片段，染色质固缩等。

热疗与化疗联合应用对肝癌细胞DNA损伤情况如(图5)所示。(图5，左图)琼脂糖凝胶电泳结果出现DNA smear条带，表明在不同的处理条件下，对HepG2细胞造成了不同程度的DNA损伤(UVB作阳性对照组)，热疗与化疗联合应用组强于单独处理的给药组和热疗组。由于DNA分子很容易受到细胞新陈代谢、毒素和紫外线的破坏，DNA受损可能导致有害的DNA突变和死亡，因此细胞进化出了DNA修复机制。DNA-PK是DNA修复的关键蛋白激酶，参与了非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)，它由3个亚基组成：Ku80、Ku70和DNK-PKcs，在NHEJ中，Ku70与Ku80能在断裂的DNA末端迅速组装成Ku异二聚体，招募并激活DNA-PKcs，因此DNA-PKcs是NHEJ途径的关键组成部分，也是一种潜在的癌症治疗靶标，可以通过抑制DNA-PKcs活性，使肿瘤细胞对电离辐射(IR)和DSB诱导剂等敏感，从而提高放疗和化疗效果[19]。(图5，右图)WB结果显示，我们进行热疗与化疗联合应用诱导HepG2细胞中DNA-PK的降解，抑制DNA-PKcs、Ku80活性，抑制DNA修复，提高CDDP化疗效果，促进肿瘤细胞凋亡发生。

图5 HepG2细胞在联合应用对DNA损伤的影响(左图凝胶电泳、右图WB)  

3、结论

肿瘤的治疗注重综合治疗，热疗已成为综合治疗手段中非常重要的一种辅助手段[20]，合理有效配合常规治疗可以提高对常规放化疗不敏感的肿瘤的控制率，更好的改善生存率。

在我们的研究中，针对HepG2肝癌细胞进行热疗与化疗联合应用，基于caspase-8的积累筛选出最佳处理条件为43℃加热1 h和CDDP(10μg/mL)。在此条件下，结果显示联合应用诱导caspase-8的积累和激活，同时使caspase-3的激活增加，细胞活力下降，细胞凋亡增加。并对联合应用促进caspase-8的积累的原因进行了初步探讨，结果显示CUL3作为E3连接酶与caspase-8通过K63连接泛素化积累有关。另外，细胞不断受到外源性和内源性应激物的干扰，这些外源性和内源性应激物可能导致DNA损伤，从而触发DNA损伤反应(DDR)，然后激活DNA修复通路。据报道，癌细胞会自行修复抗癌药物引起的DNA损伤，而加热能阻止癌细胞的自我修复，但是，其中的潜在机制尚未完全阐明。本文中加热与化疗药CDDP联合应用会造成肝癌细胞DNA损伤，并影响非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复，诱导HepG2细胞中DNA-PK的降解，抑制DNA-PKcs、Ku80活性，抑制DNA修复，提高了CDDP化疗效果，促进肿瘤细胞凋亡的发生。我们的研究揭示了一种新的热疗与化疗联合治疗诱导细胞死亡的机制，研究结果为临床实践中实施热疗与化疗联合治疗癌症提供了理论支持。

参考文献:

[4]吴聪英,周翠,张捷.42℃热疗抑制U251细胞增殖并诱导凋亡[J].生物化学与生物物理进展,2022,49(11):2240-2246.

[17]徐晓浩.石斛多糖对皮肤光损伤的修复作用及其机制研究[D].长春中医药大学,2023.

[18]吴志鸿.紫外线诱导的人LEC DNA损伤修复机制及抗氧化剂的拮抗作用的实验研究[D].中国医科大学,2005.

[20]王慧霞,蔡宏懿.热疗在宫颈癌治疗中的研究进展[J].癌症进展,2022,20(19):1958-1962.

文章来源:字光慧,陈瑾,王越等.热疗与化疗联合应用抑制肝癌细胞DNA损伤修复诱导细胞凋亡的机制研究[J].广东化工,2024,51(04):129-132.