胆管癌(cholangiocarcinoma, CCA)的发病率占消化道恶性肿瘤的3%,是第二大常见的肝胆恶性肿瘤[1],在过去几十年中，其总体发病率在全球范围内逐渐升高[2]。CCA的标准治疗主要为手术根治性切除，由于CCA在早期阶段发病隐匿，患者通常因出现梗阻性黄疸就医，但此时已多属于中晚期，加之其对放射治疗[3]及化学治疗[4]缺乏敏感性，导致CCA患者的诊疗预后很差[1,5]。对于不可切除的CCA,临床治疗则以缓解梗阻性黄疸症状、提高生活质量为主，可接受的姑息性治疗手段包括外科手术胆道减压、经皮肝穿刺或经内镜途径胆道引流术和支架置入术，但是这些治疗方式对于延长患者生存期作用甚微[6]。因此，开发新的CCA治疗手段，对于晚期不可切除的肿瘤患者具有重要价值。

光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)作为一种新颖的局部微创疗法，具有创伤小、安全、可重复、副作用少等优势，与其他肿瘤的消融方式(如手术、冷冻消融、微波消融、射频消融等)相比，PDT介导的肿瘤治疗选择性更高，因此在抗癌治疗中具有一定的应用潜力。多项临床研究已证实了单独的光动力治疗或联合其他治疗(如胆道支架置入术、化疗)可以显著改善CCA患者临床症状和延长中位生存期[7,8]。我们通过医工-交叉合作平台构建了一种新的阳离子热激活延迟荧光(thermally activated delayed fluorescence, TADF)荧光素衍生物(DCFP-Cl)作为特殊光敏剂(图1)[9],本文主要在体外实验、裸鼠体内实验中探讨DCFP-Cl介导的PDT对CCA细胞系的诊疗作用及潜在作用机制，可为后续深入的研究提供可靠的实验依据。

图1 DCFP-Cl的化学结构式   

1、材料与方法

1.1 实验材料

实验所用细胞株选用人肝胆管癌细胞(RBE),由中国科学院上海细胞库提供，DCFP-Cl由大连理工大学精细化工国家重点实验室宋锋玲课题组提供。

1.2 实验方法

1.2.1 DCFP-Cl在RBE细胞内的摄取与定位实验

DCFP-Cl的配制：应用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)溶解DCFP-Cl颗粒，配制成DCFP-Cl 1 000 μmol/L母液，于-20 ℃冰箱内长期避光保存。

RBE细胞对DCFP-Cl的摄取实验：将RBE细胞接种在35 mm普通培养皿中培养24 h, 细胞贴壁生长后，弃去原培养基，避光条件下向培养皿中加入含DCFP-Cl(10 μmol/L)工作液，继续放入孵箱孵育60 min。随后，弃掉原培养基，细胞用PBS缓冲液(pH=7.4)洗涤3次后成像。

DCFP-Cl细胞亚定位实验：(1)将RBE细胞接种在35 mm的玻璃底皿中培养24 h后，用DCFP-Cl (10 μmol/L)孵育60 min, 然后取出培养液，PBS洗涤3次，加入Mito-Tracker Green (100 nmol/L)或DAPI,再孵育10～30 min, PBS洗涤。最后将培养皿置于共聚焦激光扫描显微镜下成像并拍照，其中Mito-Tracker Green(绿色通道)的荧光图像通过488 nm激发，在500 nm到525 nm之间采集，DAPI的荧光图像(蓝色通道)在340 nm处激发，在420～500 nm之间采集，在512 nm激发下，DCFP-Cl的荧 光图像(红色通道)在610～690 nm之间采集；(2)根据DCFP-Cl与 Mito-Tracker Green、DAPI的荧光强度相关性分析，使用Image J软件。

1.2.2 钙黄绿素AM(Calcein AM)检测实验

RBE细胞分别进行如下处理：(1)对照组：Calcein AM (2 μmol/L)孵育30 min; (2)先用DCFP-Cl孵育60 min, 再用Calcein AM (2 μmol/L)孵育30 min; (3)用DCFP-Cl孵卵60 min, 再使用光动力治疗仪照射(630 nm, 40 mW/cm2,照射20 min),然后用Calcein AM (2 μmol/L)孵育30 min。在488 nm激发下，在500～550 nm之间采集Calcein AM(绿色通道)荧光图像。

1.2.3 ROS单态氧检测实验

(1)实验分组、培养及处理均与Calcein AM检测实验相同；(2)按实验计划接受不同处理后，各组培养皿弃去培养基，并按照试剂说明书加入适当浓度DCFH-DA活性氧探针，继续置于细胞孵箱中孵育30 min; (3)PBS缓冲液轻轻洗涤3次后置于共聚焦激光扫描显微镜下成像并拍照。DCFH- DA活性氧探针试剂使用488 nm激发光，于500～520 nm(绿色通道)之间采集荧光图像。

1.2.4 CCK-8法细胞毒性检测实验

(1)分组：按实验计划分组：DCFP-Cl组与DCFP-Cl/光照组(光敏剂浓度均依次为0、2、4、6、8、10、12、14 μmol/L,光照组光照条件为630 nm, 能量密度40 mW/cm2,10 min),每个亚组各设置4个复孔。(2)首先将RBE细胞铺板至96孔板中，于孵箱中培养24 h, 然后用不同浓度的DCFP-Cl孵育1 h。除去培养基溶液，小心地加入新鲜培养基。光照组按设置条件照射细胞10 min。接受不同处理后的两组细胞继续于孵箱孵育4 h后通过CCK-8法测定细胞存活率。

1.2.5 细胞的FACS分析

RBE细胞分别采用以下不同处理方式进行孵育：(1)对照组：Annexin V-FITC (5 μL)和PI (5 μL)孵育30 min; (2)光照10 min组：用DCFP-Cl孵育60 min, 再用光动力治疗仪照射(40 mW/cm2,630 nm, 10 min),最后用Annexin V-FITC和PI孵育30 min; (3)光照20 min组：用DCFP-Cl孵育60 min, 光动力治疗仪照射(630 nm, 40 mW/cm2,20 min),然后用Annexin V-FITC和PI孵育30 min。流式细胞仪定量细胞凋亡数量。

1.2.6 构建荷瘤动物模型

(1)裸小鼠4周龄，雄性，体重25～30 g, 饲养于SPF实验动物中心，符合中国医科大学动物伦理委员会管理条例(福利伦理号为：CSE202203001);(2)裸鼠经过酒精消毒后，使用微量注射器吸取混有基质胶的RBE细胞悬液(1×107个/只)于裸鼠右下肢皮下成瘤。

1.2.7 成瘤裸鼠的活体成像

RBE荷瘤小鼠被喂食21天，直到肿瘤直径长至1.0 cm左右。然后对RBE荷 瘤小鼠进行尾静脉注 射DCFP-Cl(0.1 mmol/L,0.1 mL),随即在小动物成像系统上检测0～24 h的体内荧光变化。24 h后处死所有小鼠，取出主要器官和瘤体(心、肝、肺、肾及肿瘤)进行荧光成像。

1.2.8 皮下成瘤裸鼠光动力治疗

(1)RBE荷瘤裸鼠皮下肿瘤体积接近100 mm3时，取20只小鼠称重，随机分为以下4组：空白对照组、DCFP-Cl组、单纯光照组及DCFP-Cl/光照组；(2)按实验分组完成尾静脉注射后8 h, 将气体麻醉后的裸鼠置于光动力治疗仪下光照(光照条件：能量密度40 mW/cm2,630 nm, 20min);(3)每3天治疗一次(第0天、第3天和第6天),持续1周，最后1周为观察期，2周内每2天测量肿瘤体积和裸鼠重量；(4)用卡尺测量肿瘤大小，使用公式V=(a×b2)/2计算肿瘤体积(V),其中a和b分别为肿瘤的最长直径和最短直径。实验结束后立即处死所有小鼠，并取出主要脏器及肿瘤进行HE和TUNEL染色。

1.3 统计学方法

使用SPSS 26.0软件对研究中数据进行统计学分析，计量数据采用均值±标准差表示。光照治疗10 min与20 min的比较使用独立样本t检验分析，细胞凋亡率和体内实验中不同分组裸鼠的肿瘤体积及裸鼠重量采用单因素方差分析，当P<0.05时，表示差异具有统计学意义，相关性分析采用皮尔森相关性检验，r=0.6～0.8为强相关。

2、结果

2.1 RBE细胞对DCFP-Cl的摄取及亚定位

为了评估DCFP-Cl的诊断能力，本研究首先使用荧光显微镜观察RBE对DCFP-Cl的 摄取情况。如图2所示，在孵育DCFP-Cl的细胞中观察到明显的红色荧光，说明DCFP-Cl可以被CCA细胞充分摄取并进入细胞内，具备成像潜力。为了进一步验证DCFP-Cl可特异性积聚于线粒体中，本研究应用光敏剂DCFP-Cl、线粒体定位探针Mito-Tracker Green(绿色荧光)与细胞核定位染料DAPI (蓝色荧光)共同孵育细胞，并观察其共表达情况。如图3所示，细胞内DCFP- Cl的红色荧光与线粒体探针的绿色荧光重叠现象明显，皮尔森相关性分析结果示：两者的皮尔森相 关系数为0.78±0.07,呈强相关。该结果说明DCFP-Cl可进入RBE细胞并靶向在线粒体内。

图2 RBE细胞孵育DCFP-Cl(×40)   

图3 RBE细胞的亚定位实验(×100)及相关性分析  

2.2 DCFP-Cl在活细胞中的PDT效率

根据上述实验结果，提示DCFP-Cl可特异性进入RBE细胞线粒体内，并发挥作用，可用于CCA的进一步研究。为了进一步评估DCFP-Cl的治疗效果，本研究使用Calcein AM染料来区分活细胞和死亡细胞。通过倒置荧光显微镜的荧光图像验证PDT对RBE细胞是否具有毒性作用。如图4A-C所示，各组经不同处理后，均孵育Calcein AM,其中对照组和仅孵育DCFP-Cl的细胞呈现出明显的绿色荧光，这意味着DCFP-Cl在没有被特定波长激光照射的情况下，对RBE没有毒性作用，而经光动力治疗仪照射后，未见明显绿色荧光，这表明DCFP-Cl对RBE细胞具有良好的PDT效果，推测其原因可能是细胞内DCFP-Cl的PDT过程中，促使RBE细胞内产生大量1O2。

为了确认RBE细胞内1O2的作用效果，本研究使用DCFH-DA(活性氧探针)来研究这一过程，DCFH-DA的绿色荧光强度取决于细胞中1O2的含量。结果显示 (图4D-F):与其他两组相比，DCFP-Cl光动力治疗后的CCA细胞显示出明显的绿色荧光。提示DCFP-Cl经光照后可促进RBE细胞产生1O2,发挥PDT作用。

图4 各分组细胞活力检测实验及单态氧检测实验(×40)   

本研究采用CCK-8法定量检测DCFP-Cl在RBE细胞中的PDT的效率，并同时检测了DCFP-Cl的暗毒性。在黑暗条件下，RBE细胞孵育DCFP-Cl细胞存活率随浓度梯度增加而无明显变化，且均高于 90%,该结果表明新型光敏剂没有明显的细胞暗毒性(图5A);而使用光动力治疗仪照射后，治疗组中细胞存活率随浓度增高而降低，并通过计算得出DCFP-Cl的IC50为7.12 μmol/L(图5B),这表明较少剂量的DCFP-Cl就可诱导细胞死亡。

图5 CCK-8法检测细胞毒性实验 A:黑暗条件；B:加用光动力治疗仪照射后。   

图6 不同照射条件下RBE细胞的FACS分析   

2.3 裸鼠体内DCFP-Cl的荧光成像能力

基于DCFP-Cl在体外实验中的摄取及诊断性能，本研究探讨了DCFP-Cl在活 体肿瘤区域的积累效应。将DCFP-Cl通过尾静脉注射荷瘤小鼠，观察裸鼠随时间的荧光成像变化。结果显示(图 7):光敏剂注射后分布于全身，但随着代谢的进行 DCFP-Cl在2 h后可在肿瘤区域积聚，8 h内聚集效果最佳，且荧光强度可维持至24 h。24 h后处死裸鼠，解剖其肿瘤及主要脏器(心脏、肝脏、肺脏与肾脏)后再次成像。如图7所示，DCFP-Cl在肿瘤区域特异性聚集，这表明DCFP-Cl与CCA肿瘤组织细胞具有良好的结合亲和力，具有应用于肿瘤早期诊断的潜力。

图7 动物活体荧光成像   

2.4 DCFP-Cl对荷瘤小鼠的治疗作用

根据上述结果，本研究进一步观察了DCFP-Cl对荷瘤小鼠的治疗效果。图中(图8),光照组、DCFP-Cl组及对照组肿瘤的大小随着时间的延长逐渐增大，仅DCFP-Cl/光照组肿瘤大小明显受到抑制(F=26.82,P<0.001),且见坏死组织脱落后的瘢痕，说明DCFP-Cl介导的PDT对荷瘤小鼠具有良好的治疗作用。同时发现，DCFP-Cl组荷瘤小鼠的体重没有明显变化，可能与DCFP-Cl具有较低的暗细胞毒性有关。为了进一步观察DCFP-Cl的治疗效果，本研究将四组肿瘤进行切片处理(图9A),HE染色中四组肿瘤均未见明确坏死，仅见DCFP-Cl/光照组的包膜不完整，随后进行的TUNEL染色中仅DCFP-Cl/光照组残余肿瘤边缘可见明显的细胞凋亡，而其他各组肿瘤组织均未见明显异常。该结果表明，在630 nm光照射下，DCFP-Cl确实能诱导肿瘤细胞凋亡。同时，各组荷瘤小鼠重要脏器的HE染色结果显示(图9B)主要脏器均未受损，进一步证明DCFP-Cl介导的PDT具有良好的生物相容性。

图8 不同分组荷瘤裸鼠的实验结果   

图9 肿瘤组织及重要脏器的组织学分析   

3、讨论

临床上常采用放射线和化学药物治疗不可切除性CCA,但目前没有充分的证据表明辅助放疗与化疗能够明显改善患者的生存获益，且两者均不能有效降低术后复发率[10]。因此，高度恶性的CCA治疗面临困难，PDT作为新兴的局部姑息治疗，为不可切除CCA的姑息治疗提供了新的选择[11,12]。PDT 的主要机制为[13]:(1)对癌细胞的直接损伤[14];(2)引起肿瘤组织内的血管损伤[15];(3)激活抗肿瘤免疫反应[16]。PDT的关键要素包括光敏剂(photosensitizer, PS)、特定范围波长的光和溶解在细胞中的氧气[17]。光敏剂是实现PDT的关键环节，现如今的光敏剂可分为三类：非基于卟啉的第一代、第二代光敏剂和具有靶向性的第三代光敏剂[18],光敏剂作用特异性的增加，不但顺应了精准医疗策略的发展大背景，而且增加了PDT的效果。

第三代光敏剂特异性亚细胞靶点包括溶酶体[19]、线粒体[20]、高尔基体[21]、内质网[22]等细胞器，具有高度选择性的光敏剂使体内药代动力学得到改善，降低了治疗所需剂量，并相应的减少了药物副作用，因此，本研究所应用的线粒体靶向治疗策略具有巨大潜力，这归因于线粒体在调节肿瘤细胞凋亡、代谢等方面的重要作用，并且更容易受到高热和氧化损伤的影响[23]。现有线粒体靶向策略是主要利用一些亲脂性和阳离子基团(三苯基膦阳离子、过渡金属配合物、胍或双胍等)与药效团相连来增强线粒体摄取[24],如PENG[25]的小组开发了pH控制的电荷反转胶束(带正电荷的三苯基膦胶束负载有二氢卟吩e6),它可以在酸性肿瘤细胞外基质中将阴离子电荷变为阳离子电荷，使光敏剂(二氢卟吩e6)在肿瘤组织中积累。但由于线粒体膜电位(MMP)动态变化导致光敏剂无法在肿瘤组织细胞中长时间停留，难以发挥最大治疗效果[26]。为了解决以上问题，我们创新性选用了靶向线粒体的阳离子光敏剂(DCFP-Cl),通过 与线粒体之间发生共价结合，使其稳定积累在癌细胞内，在初步探究中已探索了其对人乳腺癌细胞(MCF-7)的有效性[9]。本研究从疾病的诊断及疗效方面，分析DCFP-Cl介导的PDT对人源性CCA细胞系的作用，为进一步探究其临床应用提供了理论基础。

光动力诊断(photodynamic diagnosis, PDD)是一种使用光敏剂检测癌细胞的诊断措施。当暴露在可见光下时，会产生荧光，有助于早期发现癌前病变[27]。其中光敏剂5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)作为PDD识别癌症部位的有前途的药物备受关注，如MOTOORI等[28]应用ALA- PDD联合诊断性腹腔镜/膀胱镜可及时检测出肿瘤患者的淋巴结转移，在8例食管癌患者术后的292个淋巴结中，通过组织病理学评估，21个(7.2%)淋巴结为PDD阳性，19个(6.5%)淋巴结为组织学阳性，表明该技术的检测敏感性高于组织学评估，这对于癌症的治疗和生存率至关重要。在现有的光动力诊疗一体化分子和材料的设计策略中，通常以一些传统的荧光染料或三重态染料为光敏剂。常见的有机荧光染料如罗丹明、荧光素和氟化硼二吡咯等普遍具有比较短的三重态寿命，光敏化效率较低，使得应用中荧光亮度不足，在成像检测的诊断能力上有缺陷。同时这些有机染料的光稳定性都比较差，无法提供稳定的PDT效果，这些问题严重限制了它们在光动力诊疗一体化上的实际应用能力。具有热激活延迟荧光特性的新型荧光素衍生染料具有优良的光学性能，这类衍生染料在室温条件下具有较长的发光寿命，还表现出优异的单线态产氧能力[29]。在我们既往的研究中[9],通过对DCFP-Cl的理化性质测定，已证实了该光敏剂具备TADF的性能，形成的三重态具有2.57 μs的发光寿命，因此该光敏剂属于新型三重态光敏剂染料，具有良好的治疗与诊断潜力，这为本研究体内、外实验提供了关键基础。

在RBE细胞系及其动物模型中，本研究结果显示了肿瘤细胞对DCFP-Cl良好摄取及荧光成像能力，并通过引入线粒体荧光探针进行亚细胞定位，DCFP-Cl的红色荧光与线粒体荧光探针的绿光范围高度重叠(皮尔森系数 为0.78±0.07),进一步印证了DCFP-Cl特异性靶向线粒体的特征。动物模型中，DCFP-Cl在不经修饰的情况下经循环系统进入体内随时间变化集聚在肿瘤上，以8 h内聚集效果最佳，且荧光可维持至24 h甚至更长的时间，并且24 h后解剖裸鼠主要脏器内未见明显光敏剂集聚，表明该光敏剂具有稳定的肿瘤荧光成像能力，这对临床CCA早期诊断及明确受累范围很有帮助。

对于本研究中DCFP-Cl在肿瘤组织的特异性聚集，我们推测这可能与肿瘤细胞膜本身表现出比正常细胞膜有更多的负电荷有关[30],更有利于阳离子DCFP-Cl渗透入肿瘤组织内。就提高肿瘤的特异性摄取而言，目前研究人员尝试了以纳米颗粒作为光敏剂载体，通过被动靶向的物理化学优化、主动靶向的配体修饰以及刺激响应释放实现了光敏剂向肿瘤组织的有效递送[26],并已经使用不同的材料(如聚合物、脂质体、金、二氧化硅、碳和氧化铁)开发了各种类型的纳米粒子，这些材料在许多研究中都显示了广阔的应用前景。与此同时，我们合作课题组的人员先后通过尝试以脂质体[9]及生物素[31]包裹光敏剂，初步探索了光敏剂对肿瘤精准投放的有效性。其中以生物素共价修饰Ⅱ型光敏剂的研究成果最为突出，该策略使其成为了兼备PDT的Ⅰ和Ⅱ机制的光敏剂分子，这种设计使得光敏剂可同时具备肿瘤靶向和耐缺氧的性能。

理想的情况下，光敏剂本身应该是无毒物质，具备纯度高、化学结构单一、性质较稳定、ROS产量高等特点[32]。因此本实验同时探索了DCFP-Cl对人肝CCA RBE细胞的细胞毒性和安全性，通过体内外实验，针对RBE细胞系或荷瘤裸鼠仅仅给予光敏剂DCFP-Cl或者单独光照，并不能抑制细胞生长或者杀伤肿瘤细胞。只有当DCFP-Cl接受光照时，CCA细胞的生长才会被明显抑制，这符合PDT需同时必备关键因素条件才能表现出高效的治疗效果，通过流式细胞仪检测，发现DCFP-Cl介导的PDT主要机制为诱发RBE细胞凋亡，这与体内实验中残留肿瘤组织边缘的TUNEL染色结果一致。此外在CCK-8实验中，黑暗条件下，随光敏剂浓度增加各组间未见明显细胞死亡，表明了DCFP-Cl对CCA的低暗毒性，这在随后的动物模型中，阳性对照组(DCFP-Cl组)HE染色内未见体内脏器出现明显的坏死进一步得以证明。

本研究中动物实验观察期结束，实验组仍可见少许残留肿瘤组织，该治疗不完全可能跟光照深度有限有关，已知在可见光区，组织穿透深度随波长的延长而增加。因此，短波光无法传递到深部组织，可能会导致肿瘤PDT不完全和再生[26]。为了克服组织中的光衰减，提高深部肿瘤的治疗效果，以往研究人员尝试了各种方法，包括上转换纳米粒子[33]、双光子激光[34]、X射线[35]和生物发光[36]等。临床上，CCA的PDT主要为腔内治疗，其光照的引入通过内镜下逆行胰胆管造影或经皮肝胆管穿刺通路置入光纤得以实现[37],这为DCFP-Cl未来的临床应用指明了方向。但该研究仍有一些不足：研究通过实验验证了该光敏剂具有出色的体内、外PDT效果，但并未深入探究该光敏剂在体内的药物代谢情况；同时初步证明了该光敏剂介导的PDT通过产生ROS诱导细胞凋亡，但缺乏其具体PDT机制的探索；并且体内实验中所使用的裸鼠缺乏细胞免疫，无法观察到PDT所诱发的免疫效应对肿瘤的影响，在今后的工作中仍需继续深入挖掘。

综上所述，本研究设计并合成了一种应用及操作简便，具有优秀的肿瘤诊疗一体化的新型光敏剂DCFP-Cl, 为晚期不可切除CCA患者的替代治疗提供了宝贵的研究基础。

参考文献:

[5]许本杰,郑桐森.胆管癌内科治疗研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(10):1788-1793.

基金资助:中央高校基本科研业务费资助项目(编号:LD202016);

文章来源:吴琳,舒禹铭,郭航成,等.光敏剂DCFP-Cl介导的光动力治疗在胆管癌中应用的实验研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(11):1955-1963.