摘要:盆腔炎性疾病(pelvicinflammatorydisease,PID)动物实验常用的造模方法有物理性方法、化学性方法以及生物性方法,临床多采用白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子-α、C反应蛋白、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、TLR信号通路等指标作为中医药治疗盆腔炎性疾病的药效学观察指标。这些造模方法各有优缺点,今后如何建立更加标准化的动物模型尚待进一步规范。目前,中医药治疗PID的疗效已通过临床和动物实验得到证实,但中医药治疗PID的相关疗效机制有待进一步挖掘。
盆腔炎性疾病(pelvicinflammatorydisease,PID)是女性上生殖道炎症引起的一组感染性疾病,其患病率较高,且呈现出年轻化的趋势[1]。PID是中医药治疗的优势病种[2],中医药治疗PID的相关机制研究也在逐步深入,构建动物模型是研究的重要方法。现将PID动物模型的构建方法及中医药治疗PID的药效学实验研究进展予以综述。
1、造模方法
1.1物理性方法
1.1.1异物置入刺激法
异物置入刺激法大多选择在一侧子宫内放置异物造成大鼠盆腔炎后遗症模型,一般选择放置塑料管。此方法也是手术造模的一种,造成的病理结果与人类的盆腔炎有一致性,对子宫的损伤程度小,但是该方法操作繁琐,难度较大,不可控因素较多[3]。谢紫烨等[4]采用此法成功造模,在充分麻醉大鼠的前提下经手术暴露子宫,将一侧子宫做一横切口放入塑料管,28d后处死大鼠,可明显观察到大鼠子宫肿胀、宫腔内有积液及组织粘连等病理表现。
1.1.2机械损伤加细菌感染法
具体操作方法如下:麻醉大鼠,无菌条件下行剖腹术,暴露子宫,用针头搔刮一侧子宫内膜,使之出现器质性损伤,然后注入细菌悬液,另一侧子宫不做处理,以便对照。马玲[5]采用此联合方法成功造模,术后15d,病理显示子宫内膜上皮细胞脱落或增生,间质细胞被纤维组织所取代,腺体变形及管腔壁空泡样改变病,说明造模成功。
1.2化学性方法
1.2.1苯酚胶浆致炎法
苯酚胶浆致炎法是应用较早,也较为成熟的造模方法[6]。目前,国内关于此种造模法可参考文献较多,具体操作方法:在大鼠一侧子宫内注入苯酚胶浆,致炎剂的浓度和剂量可根据具体实验需要灼伤的程度而定,造成子宫的化学性灼伤以及炎性粘连和阻塞,成模时间为7d。余晓晖等[7]采用此方法成功造模,术后7d肉眼和镜下均可发现模型组大鼠子宫充血、肿胀、粘连等炎性反应。
1.2.2盐酸致炎法
盐酸具有强烈的腐蚀性,注入机体后能引起组织的充血水肿以及灼伤,造成炎性病理反应。刘庆等[8]用盐酸致炎法成功建立了子宫内膜炎模型,具体操作方法:将大鼠麻醉后,分别在两侧子宫内注入盐酸,造模后第23天取出大鼠子宫于镜下可见子宫内膜充血水肿以及炎性细胞浸润。
1.3生物性方法
生物性方法包括内源性病原体法和外源性病原体法,内源性病原体有需氧菌和厌氧菌两种,正常状态下厌氧菌与需氧菌的比例为5:1,二者处于动态平衡状态。生殖系统的外源性病原体主要为淋病奈瑟菌、沙眼衣原体以及解脲支原体等。
1.3.1内源性病原体造模法
内源性病原体主要为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。黄凤珍等[9]采用此法造模,将含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的混合菌液接种于大鼠阴道内4周,成功建立了急性和慢性盆腔炎模型。接种的菌液既可是单一类型的细菌,也可以是多种类型混合的菌液,临床上盆腔炎多为混合感染。因此,运用此法造模更倾向于多种类型的混合菌液。
1.3.2外源性病原体造模法
具体操作方法如下:造模大鼠首先经雌激素干预1周,然后在大鼠阴道内注入外源性病原体。张连娣等[10]采用此种方法造模,在接种7d后进行阴道分泌物检测发现典型的“煎蛋样”解脲支原体菌落,说明造模成功。
目前,国内大多数学者采用手术行机械损伤法联合细菌感染造模,或者用苯酚胶浆致炎法进行化学性烧伤造模,国外则多采用生物性方法造模。从发病机制来看,异物置入刺激法因其发病途径及致病机理与人类盆腔炎性疾病有所不同,目前已较少使用;机械损伤联合细菌感染被较多的妇科学者采用。机械损伤造成的炎性反应也是引起盆腔炎的一种病因,联合细菌感染法可更接近人类的发病过程;苯酚胶浆致炎法虽与人类的发病机制有一定区别,但是其造成子宫充血水肿、炎性粘连和阻塞与临床盆腔炎性疾病后遗症(sequelaeofpelvicinflammatorydisease,SPID)相似[11];盐酸致炎法因其具有强烈的腐蚀性而应用较少;生物性方法造模更接近人类盆腔炎的发病机制,从阴道注入病原体使其沿生殖道上行从而引起感染,与人类的致病途径相一致,但是细菌上行感染更接近急性期盆腔炎感染,与SPID的病变特点存在些许差异,故单一的病原体造模目前国内运用较少。从成模时间以及造模难度来看,异物置入刺激法造模过程复杂、重复性较低[12];机械损伤联合细菌感染法可短时间内成模,且造模成功率高,其致病特点与发病机制都与人类相一致;化学性灼伤法也是手术造模的一种,对致炎剂的浓度与剂量精确性要求较高,苯酚胶浆致炎法1周内可快速成模,造模成本低廉,可复制性好,该法在相当长的一段时间内被广泛采用;生物性方法成模时间一般需要20d左右,且菌液的浓度和剂量操作难度较大,目前,国内应用此法造模并不十分广泛。侯金萌等[13]将苯酚胶浆造模与混合细菌悬液造模方法进行了对比,得出的结论是:苯酚凝胶造模方式与人类盆腔炎的致病原因有区别,但其费用低、造模成功率更高;混合细菌悬液的造模方式与人类盆腔炎致炎途径类似,但感染率较高。
2、中医药治疗PID的药效学观察指标
2.1白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-2、IL-6与PID
白细胞介素具有介导T、B细胞活化、增殖与分化及参与炎症反应的作用。与盆腔炎关系最为密切的是IL-1、IL-2、IL-6。IL-1由活化的巨噬细胞所产生,其存在形式为IL-1α和IL-1β,其中IL-1β与盆腔炎呈正相关,作为一种促炎因子,能加重盆腔炎的炎症反应[14]。吕耀中等[15]发现,散结镇痛胶囊能有效降低盆腔炎大鼠体内的IL-1β水平。李芳园等[16]用复方藤酱汤保留灌肠治疗慢性盆腔炎,可有效降低患者体内IL-1β水平。
IL-2主要是由CD4+和CD8+T细胞产生,《2012年欧洲盆腔炎治疗指南》[17]将IL-2、血清C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)及血液流变学等指标作为盆腔炎症感染的重要检测指标。秦翠梅等[18]认为,检测IL-2对确诊盆腔炎症感染患者具有十分重要的作用。何凤蝶等[19]将盆腔炎患者与健康妇女的血清进行对比,发现PID患者血清中IL-2较健康妇女均有明显变化。梁嘉雯[20]用五味消毒饮加减联合妇炎灌肠方治疗湿热蕴结型盆腔炎患者,可有效降低IL-2水平。
IL-6作为启动炎症反应的关键因子,主要由单核巨噬细胞产生[21],对盆腔炎早期诊断具有重要意义,IL-2和IL-6都是机体应对炎症损伤而产生的炎性因子[22]。张继等[23]认为,IL-6水平的异常有助于盆腔炎的确诊。丁晓萍[24]通过酶联免疫法测定盆腔炎患者血浆、宫颈分泌物和子宫内膜活检标本中IL-6水平,也认为IL-6能辅助诊断盆腔炎,并且可作为上生殖道感染的有效标记物。黄美英[25]采用活血通络汤治疗盆腔炎性疾病后遗症,结果显示,可有效降低IL-6水平。张慧[26]采用消炎逐瘀汤联合金刚藤颗粒治疗慢性盆腔炎患者,治疗后IL-6水平明显降低。
2.2肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)与PID
TNF-α是由活化的单核巨噬细胞和其他多种细胞产生,具有广泛的生物活性,参与炎性反应和免疫应答。TNF-α在盆腔炎中可使炎症细胞在病变部位聚集加重炎症反应[27]。王国全等[28]研究显示,TNF-α可通过调控JAK2/STAT3信号通路来放大炎症反应,促使机体发挥致炎调控作用。朱平等[29]认为,TNF-α在参与急性期炎性反应和免疫应答时,能促进炎性因子释放,刺激内皮细胞并介导炎症反应,从而引起大鼠的微循环发生障碍,导致血液流变性改变,抑制机体的免疫功能。帅思议等[30]采用益气消瘀汤联合耳穴压豆治疗盆腔炎性疾病,可有效改善患者TNF-α水平,减轻炎症反应。左玲等[31]采用朱氏盆炎汤治疗湿热瘀结型盆腔炎也可有效降低TNF-α水平。
2.3CRP与PID
CRP产生于肝脏中,属于肝脏合成机制中产生的急性时相蛋白,当机体处于炎症反应和组织损伤时,血清CRP会迅速升高。徐美秀[32]研究发现,盆腔炎患者血清CRP表达异常。国外研究者指出[33],在疾病发展过程中,活化的补体能加强巨噬细胞吞噬功能持续作用,在感染初期CRP水平快速上升,故在盆腔炎等不同炎性疾病中CRP也可作为预测指标之一。研究显示[34,35],银翘红酱汤、当归芍药散均可有效降低盆腔炎患者CRP水平。
2.4T淋巴细胞、自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)与PID
T淋巴细胞是机体最主要免疫细胞之一,其水平的高低能决定机体免疫水平及调控状态。王依静等[36]研究证实,盆腔炎患者血清Th1/Th2水平及外周血T淋巴细胞亚群呈现相对异常的状态。张秀荣等[37]采用银蒲四逆四妙失笑散治疗盆腔炎,可有效改善CD4+/CD8+水平。
自然杀伤细胞属于免疫细胞的一种,不仅具有抗病毒感染、抗肿瘤的作用,也能够识别靶细胞,杀伤介质。夏富龙[38]通过比较盆腔炎患者治疗前后外周血NK细胞水平,发现盆腔炎1号方能够通过增加外周血NK细胞的浓度从而起到杀菌抗菌作用,提高机体的免疫力。
2.5微循环改变、血液流变学与PID
PID是盆腔组织长期炎症浸润而引起增生,局部充血肿胀,产生炎性粘连和阻塞,从而引起子宫局部微循环障碍,压迫神经纤维,引发腹痛等症状[39]。宫颈微循环状态的改善也可作为衡量盆腔炎药效学的指标之一。刘立鑫等[40]通过比较两组患者局部微循环指标,发现桃红四物汤能够改善宫颈的局部循环,缓解炎性症状。卢土莲等[41]采用盆炎净Ⅰ号方治疗慢性盆腔炎患者,治疗后患者的宫腔血液微循环障碍显著改善。
血液流变学包括全血比黏度、全血还原黏度、血浆黏度等多项指标。李莉[42]将血液流变学作为盆腔炎的疗效观察指标,而相关的血液流变学研究也证实了慢性盆腔炎患者的血液呈高黏滞状态。贾萃[43]通过临床研究发现,妇炎宁汤能改善慢性盆腔炎患者的血液流变学指标并减轻炎症反应。
2.6TLR信号通路与PID
Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是连接非特异性免疫和特异性免疫的一类蛋白质分子,当微生物穿破机体的物理屏障,如皮肤、黏膜等时,TLR可以识别并激活机体产生免疫细胞应答。有研究表明[44],TLR可能是细菌感染与炎症形成的一个桥梁,TLR在炎症形成中的信号通路有条主线:TLR-NF-κB信号通路调控炎性介质变化。PID的发生与发展包括病原微生物感染、宿主免疫系统激活及抗感染因子释放等三个阶段。在此过程中,免疫系统的活性起重要作用。当病菌入侵生殖系统,首先被激活的先天性免疫系统即Toll样受体。TLRs为一种模式识别受体,可识别存在于细胞表面的分子标志,即病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs),其通过调节先天和后天免疫,进而在宿主抗微生物感染中起重要作用[45]。有研究表明[46],Toll样受体的变异在女性PID的发生和发展中起重要作用。袁建菱等[47]通过用免疫组织化学法检测子宫组织中TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值,运用实时荧光定量PCR检测子宫组织中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA表达变化,发现妇科千金片对盆腔炎大鼠抗炎的作用机制可能是通过调控TLR2/4-NF-κB炎性介质变化信号通路的传导而实现的。
3、结语
国内外研究者已建立了多种盆腔炎性疾病造模方法,这些造模方法各有优缺点,未来如何建立更加标准化的动物模型尚待进一步规范。目前,中医药对于缓解SPID的临床症状及体征具有显著效果,其疗效已通过临床和动物实验得到证实,但中医药治疗PID的相关疗效机制有待更进一步挖掘。
参考文献:
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文章来源:殷秀琴,余婷,黄缨.中医药治疗盆腔炎性疾病实验研究进展[J].河南中医,2021,41(09):1438-1441.
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