摘要:目的:基于数据挖掘和网络药理学方法探究中医药治疗原发性血小板减少性紫癜(ITP)的用药规律和潜在作用机制。方法:检索自2000年1月-2022年4月,CNKI、WanFang Data、VIP、CBM、PubMed、Cochrane Library及Web of Science数据库中中医药治疗ITP的相关文献,依据纳入排除条件收集其中药组方信息。以SPSS Modeler 18.0和SPSS Statistics 22.0作为统计分析工具进行用药规律分析。通过TCMSP、化学成分数据库等及SwissTargetPrediction平台获取核心药物组合的有效成分及靶点信息,通过GeneCards等疾病数据库获得ITP的相关疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集,运用Cytoscape 3.8.0软件构建潜在作用靶点-成分网络图。通过STRING 11.5和Cytoscape 3.8.0软件构建核心蛋白PPI网络。运用Metascape平台对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。结果:最终获得184首中药处方,中药210味,使用频次最高的前六味中药分别为当归、仙鹤草、黄芪、生地黄、甘草、牡丹皮。关联规则分析显示,支持度最高的药对为生地黄、牡丹皮,系统聚类分析共聚出4个新处方。对当归、仙鹤草、黄芪、生地黄、牡丹皮进行网络药理学分析,获取药物靶点306个,疾病靶点1 517个,交集靶点72个。最终获得关键成分为山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、白桦脂酸、木犀草素;筛选出核心靶点为AKT1、VEGFA、SRC、EGFR、CASP3等。GO分析得到生物过程1 203条,包括蛋白质磷酸化的正调控、细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶信号通路等;细胞组成78条,包括膜筏、膜微区等;分子功能95条包括蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性等,KEGG通路145条,与ITP相关性较大的通路为PI3K-Akt信号通路、癌症的MicroRNAs基因、MAPK信号通路等。结论:(1)中医药治疗ITP的药物,其用药类型以补益类最为常见,佐以清热凉血、收敛止血类药物等;(2)核心药物组合(当归、仙鹤草、黄芪、生地黄、牡丹皮)的主要活性成分山柰酚、槲皮素等,通过AKT1、VEGFA等靶点,参与PI3K-Akt信号通路、癌症的MicroRNAs基因、MAPK信号通路等过程,起到治疗ITP的作用。
原发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),是以出血及外周血小板减少,骨髓巨核细胞数正常或增多,伴有成熟障碍为主要表现的常见出血性疾病,以皮肤、黏膜出现瘀点或瘀斑为主要临床表现[1],约占出血性疾病总数的1/3,成人的年发病率为5~10/10万[2]。其发病主要与体液免疫及细胞免疫失调[3,4]、MicroRNA异常[5]、Hp感染[6]等因素有关。现代医学一线治疗方法主要有糖皮质激素、静脉注射人免疫球蛋白,二线治疗方法主要包括脾切除、利妥昔单抗和刺激血小板生成类药物等[7],这些治疗往往不能完全或有效缓解低血小板计数。中医药对改善该类患者临床症状、提高生活质量有着明显的效果。笔者通过挖掘国内外七大数据库中具有确切且积极治疗效果的中医处方用药信息,系统分析总结其用药规律,并运用网络药理学的方法探索其作用机制,以期为中医药治疗ITP的药物研发、实验研究和临床应用提供参考。
1、材料与方法
1.1 数据挖掘
1.1.1 文献来源
检索中国知网、万方、维普、中国生物医学文献数据库、PubMed、Cochrane Library及Web of Science数据库,检索年限自2000年1月-2022年4月。收集中医临床治疗ITP的相关文献。检索词为“原发性血小板减少性紫癜”“特发性血小板减少性紫癜”“免疫性血小板减少性紫癜”“紫癜”“中医”“中药”“Purpura, Thrombocytopenic, Idiopathic”“Idiopathic Thrombocytopenic Purpura”“Immune Thrombocytopenic Purpura”“Autoimmune Thrombocytopenia”“Medicine, Chinese Traditional”“Traditional Chinese Medicine”等。
1.1.2 文献纳入标准
①诊断符合国内外公认标准的原发性血小板减少性紫癜,无其他兼症;②中西医结合或纯中医药治疗ITP的临床文献,包括随机对照研究、临床病例观察、回顾性研究;③观察组仅采用中药汤剂内服单一方式治疗,且方药组成完备;④临床病例数≥30例且疗效明确。
1.1.3 文献排除标准
①用单味药、中成药等非中药汤药治疗的文献;②治疗过程中联合其他方法治疗者,如中成药注射液、耳穴压豆、针灸等中医外治,或观察期间中药服法改为非中药煎剂(如丸剂、颗粒剂、口服液等)方法治疗,难以排除干扰或影响者;③中药方剂无具体药物组成者;④排除综述、个案报道、经验总结、理论探讨、动物实验类及干预措施不符合文献。
1.1.4 数据处理及规范
以《中华人民共和国药典》(2020年版)为标准,并参考《中药学》(第10版),将纳入的中药命名做规范化处理。如寸冬规范为麦冬,山栀、山栀子规范为栀子,旱莲草、旱墨莲规范为墨旱莲等。对于相同药物不同炮制方法药性及功效发生明显变化的药物,分别记录。以上步骤均由两人同步进行,且经第三人核对,以确保原始数据的准确性。
1.1.5 数据整理及用药分析
①将规范后的中药信息录入Microsoft Excel 2019,建立中药组方数据库。对整理后的中药使用频次、药物类别、四气、五味及归经进行频次统计分析。②将处理好的中药数据导入SPSS Modeler 18.0软件,运用Apriori算法进行关联规则分析;将两味药在同一处方中同时出现的次数>35设置为强链接,<15设置为弱链接,介于两者之间为中等链接。将强连接及中连接的药对导入Cytoscape 3.8.0软件,绘制高频药物复杂网络图。③利用SPSS Statistics 22.0软件对高频药物进行系统聚类分析,绘制高频药物聚类谱系图,获得配伍关系紧密的药物分组。
1.2 网络药理学
1.2.1 核心药物有效成分收集及靶点预测
将核心药物输入TCMSP数据库,以口服生物利用度(Oral bioavailability, OB)≥30%,类药性(Drug-likeness, DL)≥0.18为条件进行活性成分筛选。对于TCMSP数据库中未收录的中药,通过文献查找及化学专业数据库补充其成分,将该药物的成分录入PubChem中,获得其SDF 2D结构,然后录入Swiss ADME进行成分筛选,设置潜在核心化合物的标准为肠胃吸收(Gatrointestinal absortion; GIabsortion)为“High”,设置5类药性预测(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)结果中有2个及以上为“Yes”。将以上步骤获得的所有有效成分录入SwissTargetPrediction进行靶点预测,在此基础上剔除无预测靶点的成分。
1.2.2 ITP相关疾病靶点筛选
以“Idiopathic Thrombocytopenic Purpura”“Primary Thrombocytopenic Purpura”“Refractory Idiopathic Thrombocytopenic Purpura”等为关键词,搜索OMIM、GeneCards、DisGeNET、DrugBank、DigSee、TTD 数据库,获得ITP疾病靶点,删除重复值后进行合并。利用Uniprot蛋白质数据库将疾病靶点与药物靶点统一规范为Gene Symbol, 限定条件为Homo Sapiens、Reviewed。
1.2.3 潜在作用靶点-成分网络
利用Venny 2.1.0软件对药物与疾病靶点进行映射,绘制韦恩图,获得药物-疾病交集靶点,即核心药物潜在干预ITP的靶点。将交集靶点及靶点涉及的药物成分导入Cytoscape 3.8.0软件,构建潜在作用靶点-成分网络图,筛选与疾病相关的关键成分。
1.2.4 药物与疾病交集靶点的蛋白相互作用分析
将交集靶点输入STRING 11.5平台,设置物种为“Homo sapiens”,最小互相作用阈值设置为Medium confidence(0.4),进行蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)分析。利用Cytoscape 3.8.0软件的网络分析功能获得核心靶点,并对PPI网络进行可视化处理。
1.2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
通过Metascape数据库对交集靶点进行靶点GO功能(Gene ontology, GO)及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析,设置物种为“Homo sapiens”,以P<0.01作为筛选条件,分别获得相应富集分析结果。通过微生信绘图平台绘制GO功能三合一柱状图和KEGG气泡图。
2、结果
2.1 数据挖掘
2.1.1 文献筛选结果
本研究最终纳入文献184篇,获得中药处方184首。
2.1.2 中药使用频次统计
184首中药组方共涉及210味中药,其中使用频次≥20次的高频中药有28味。见表1。
表1 高频药物(频次≥20)的使用频次及频率
2.1.3 中药类别统计
对出现频次≥50次的中药类别进行频次统计,见图1。使用频次较多的药物类别依次为补气药、清热凉血药、补血药、补阴药和收敛止血药等。
图1 中药类别统计
2.1.4 性味归经统计
对药物性味归经分别进行统计,绘制性味归经雷达图,见图2。四气以平、温、寒居多,共占74.69%。五味以甘、苦、辛为主,其中,甘味药占42.01%。归经以肝经、心经、脾经为主,以肝经频次较为显著,占25.13%。
图2 性味归经雷达图
2.1.5 关联规则分析
将关联规则分析结果按支持度由高到低进行排序,得到关联规则组合,见表2及表3。两味药及三味药组合中,支持度最高的组合主要涉及生地黄、牡丹皮、仙鹤草三味药。
表2 两味中药组合关联规则分析
表3 三味中药组合关联规则分析(前20个组合)
2.1.6 高频中药复杂网络分析
对强链接及弱链接的关联规则信息进行复杂网络分析,见图3。可见,当归、仙鹤草、生地黄、黄芪、牡丹皮之间链接紧密。
2.1.7 中药聚类分析
选取频次≥25次的中药进行系统聚类分析,设置最小聚类数:5,最大聚类数:10,绘制高频药物聚类谱系图,见图4。当距离集合为21时,聚为4类,第一类:墨旱莲、女贞子、白芍;第二类:生地黄、牡丹皮、赤芍、水牛角、甘草、茜草、紫草、鸡血藤、仙鹤草、白茅根;第三类:白术、炙甘草、茯苓、炙黄芪、党参、当归;第四类:阿胶、熟地黄、丹参、枸杞子。
图3 高频药物复杂网络
图4 高频药物聚类谱系
2.2 网络药理学
2.2.1 药物靶点及疾病靶点
居于以上数据挖掘结果,确定治疗ITP的核心药物为:当归、仙鹤草、生地黄、黄芪、牡丹皮,以此五味药进行网络药理学分析。最终获得核心药物靶点306个,疾病靶点1 517个,两者取交集(见图5)后获得交集靶点72个,即药物作用于疾病的潜在靶点。
图5 核心药物-疾病靶点交集韦恩图
2.2.2 潜在作用靶点-成分网络
构建潜在作用靶点-成分网络图(其中,7个成分靶点与疾病靶点无交集,予以删除),见图6。选取度值排名前10的核心有效成分予以展示,见表4。主要核心成分包括山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、白桦脂酸等。
图6 潜在作用靶点-成分网络
表4 核心成分一览表
2.2.3 潜在作用靶点的蛋白相互作用分析
PPI网络见图7,剔除1个与其他蛋白无连接的游离节点后,构建潜在作用靶点的蛋白相互作用分析网络图,见图8。可见,网络中的核心靶点为AKT1、SRC、VEGFA、EGFR、CASP3等。
2.2.4 GO功能富集分析结果
得到GO功能富集条目1 376条,其中,生物过程1 203条,包括蛋白质磷酸化的正调控、细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、酶联受体蛋白信号通路等;细胞组成78条,包括膜筏、膜微区、受体复合体等;分子功能95条,包括蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、乙醇基作为受体等。根据P值取前10位绘制GO功能三合一柱状图,见图9。
2.2.5 KEGG通路富集分析结果
筛选得到KEGG通路145条,取前20位进行展示,并绘制KEGG气泡图(见图10)。主要涉及PI3K-Akt信号通路、癌症的MicroRNAs基因、MAPK信号通路等。
3、讨论
中医学古籍并无原发性血小板减少性紫癜的病名记载,根据其易出血的特点,以往将其归属“紫癜”“肌衄”“血证”等范畴,为更规范诊治,现已将该病中医病名标准化为“紫癜病”[8]。《血证论》记载:“火热破血者十居八九。”急性出血病证常与火热血溢脉外有关,历代医家治疗血证,首当凉血止血。然血为气之母,出血日久,必耗正气,故治标的同时尚须补虚以固护正气。对该病病因病机的认识,现代医家基本遵循了古代医家的看法,认为该病主要特点是火盛气伤,虚实夹杂,以虚为主,治当补虚泻实,补虚为主[9,10]。
本研究对纳入文献进行了药物频次统计分析,结果显示,组方中以补益类药物最为常见,佐以清热凉血药、收敛止血药等。治疗ITP的高频药物包括当归、仙鹤草、黄芪、生地黄等。其中,当归补血活血,仙鹤草收敛止血、补虚,黄芪补气升阳、生津养血,生地黄清热凉血、养阴生津。当黄芪与当归药量比为5∶1时,即为李东垣的补益气血要方——当归补血汤,其对骨髓具有保护作用,对巨核细胞具有抗凋亡作用,能促进小鼠模型的造血和血小板生成[11,12]。平性药无明显寒热偏向,于和缓之中调和气血,寒温并用,相互制约,不致寒热太过。五味中以甘味占比最大,旨在补虚固护正气以祛邪外出或固本防变。《温热论》中道:“入血就恐耗血动血,直须凉血散血”,故以苦味药清热凉血止血。凉血易凉遏邪恋,止血有留瘀之弊,甘味药补益气血之余亦易留瘀,故配辛味药以行气行血、活血散瘀,使补血止血而不留瘀。血的生成与运行与肝、心、脾的功能密切相关,故用药多归此三经居多。两味药及三味药组合关联规则结果中,支持度最高的药味涉及牡丹皮、生地黄、仙鹤草,说明这三味药在治疗ITP的中药组方中具有关键作用。系统聚类所得的四个聚类组合总体为扶正组合,以调补肝肾、益气养血为主,清热凉血散瘀为辅,体现了ITP虚实夹杂、以虚为主的特点。以上药物频次分析佐证了ITP火盛气伤、虚实夹杂、以虚为主的病机特点,治当补虚泻实,补虚为主。
图7 STRING PPI网络
图8 潜在作用靶点蛋白互作网络
图9 GO功能三合一柱状图
图10 KEGG富集分析
基于以上数据挖掘结果,确定治疗ITP的核心药物组合为当归、仙鹤草、生地黄、黄芪、牡丹皮。以此五味药为研究主体,分析了其治疗ITP的作用机制。得出核心药物组合的关键成分为山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、白桦脂酸、木犀草素等。其中,山柰酚能显著提升与Treg细胞相关的IL-10、FOXP3和CTLA-4的RNA水平,从而提高Treg细胞的免疫抑制功能[13]。β-谷甾醇能调节Th17/Treg细胞比例,改善哮喘大鼠的炎症状态[14],对于免疫性及炎症性疾病有一定的治疗作用。槲皮素能增加血小板中抗凋亡蛋白BCL-2蛋白的表达量,降低促凋亡蛋白BAX蛋白的表达量,引起BCL-2/BAX蛋白比例升高,从而抑制Caspase-3蛋白活化引起的线粒体凋亡,进而抑制血小板凋亡[15]。白桦脂酸能降低JNK-P38 MAPK信号通路中的ASK1、JNK和P38 mRNA表达量,对地塞米松造成的氧化损伤具有保护作用[16]。木犀草素通过抑制NF-κB信号通路调控IKKβ、IκBα、P65蛋白的表达,降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达,发挥抗炎活性,并促进Nrf2的表达,降低细胞中HO-1酶的表达量,发挥抗氧化作用[17]。
AKT是PI3K下游的重要靶点,有许多结合位点,占据这些位点可以阻断AKT某一方面的功能,从而影响信号通路。AKT参与的PI3K/AKT/mTOR 信号通路与血小板自噬有关,通过诱导增加血小板自噬后,ITP患者的血小板存活率和活力提高,凋亡降低[18]。通过抑制PD1/PTEN/AKT 信号通路,能减少活化效应T细胞,增强Tregs的发育和功能,从而调节 ITP患者CD4+T 细胞的稳态[19]。SRC信号传导可以刺激多种血小板活化下游底物,尤其是血小板散布和聚集所必需的细胞成分,研究显示,SRC基因敲除小鼠的血小板在纤维蛋白原上扩散不良,进而影响血小板的功能[20],SFK抑制剂可以部分恢复骨髓纤维化患者巨核细胞中前血小板的形成[21]。VEGFA对促进血管生成,维持血管的通透性具有重要作用,且具有参与调节免疫等功能[22,23]。EGFR介导多种信号通路参与调节细胞自噬与凋亡,包括MEK/ERK信号通路[24]、PI3K/AKT1信号通路[25]等。CASP3是血小板凋亡级联过程的中心步骤[26],在慢性ITP患者中,可以观察到caspase-3活化与血小板凋亡增加有关[27],miR-557抑制剂能抑制miR-557、caspase-3和Bax的表达,上调bcl-2、p-Akt和p-ERK的表达,增加ITP模型大鼠的血小板和巨核细胞数量,改善ITP模型大鼠的症状[28]。
GO功能分析显示,核心药物治疗ITP主要包含信号转导、细胞周期调控、激酶活性调节等生物过程;主要发生在膜筏、微膜区、细胞体等细胞成分;涉及蛋白激酶活性、酶结合、蛋白激酶结合等分子功能。KEGG信号通路结果中,与ITP相关性较大的通路为PI3K-Akt信号通路、癌症的MicroRNAs基因、MAPK信号通路等。研究表明,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路能抑制血小板自噬,提高血小板活力,减轻血小板破坏,调节ITP患者的免疫失耐受[29,30]。MicroRNA通过转录后能调控基因表达,在多种生物过程中发挥关键作用,与包括ITP在内的各种自身免疫性疾病的发生与发展密切相关[31]。通过研究不同miRNA参与表达的调节免疫途径,可为ITP的治疗提供更科学的依据及新的可能。WANG Y[32]的研究显示,let-7b-5p可能增强BAFF/BAFF-R介导的信号转导变异,从而促进细胞存活和参与ITP的疾病过程。miR-106b-5p能通过NR4A3/Foxp3途径诱导Treg/Th17免疫失衡,降低miR-106b-5p的表达可促进Treg分化,增加血小板数量[33]。miR-557抑制剂能通过调节凋亡相关基因和细胞免疫并激活Akt/ERK途径,增加ITP模型大鼠的血小板和巨核细胞数量,改善ITP模型大鼠的症状[28]。MAPK信号通路与氧化应激关系极其密切,活性氧ROS可能通过引起p38MAPK的活化,影响解离素-金属蛋白酶17介导的GPIbα酶切过程,使血小板发生活化和凋亡,从而引起血小板贮存损伤,抑制p38MAPK活性能改善贮存血小板的止血功能[34,35]。
4、结论
中医药治疗ITP,其用药物类型以补益类最为常见,佐以清热凉血、收敛止血等,在遣方用药时,应在辨证论治基础上,寒热平调,以补、清为主。其中,核心药物组合可能通过山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、白桦脂酸、木犀草素等活性成分,作用于AKT1、VEGFA、SRC、EGFR、CASP3等疾病靶点,调控PI3K-Akt信号通路、癌症的MicroRNAs基因、MAPK信号通路等,发挥对ITP的治疗作用,体现了中医药通过多成分、多靶点、多通路治疗疾病的特点。深入研究这些相关作用靶点信息,通过过表达或敲除相关靶点,研究其上下游关系,可为中医药治疗ITP新机制提供参考。
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文章来源:相惠君,黄佳红,林芳芳等.中医药治疗原发性血小板减少性紫癜的用药规律和作用机制探析[J].亚太传统医药,2024,20(02):116-123.
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