成年斑马鱼放射性脑损伤模型的建立研究

2020-08-21 584 上传者：管理员

摘要：目的：建立成年斑马鱼放射脑损伤模型并研究其放射损伤改变。方法：3～6个月龄的80只成年斑马鱼随机平均分到对照组和照射组，照射组动物给予头部照射，照射剂量为20Gy。在脑组织中，利用Tunel染色检测凋亡；利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法检测炎症相关基因的表达。结果：与对照组相比，放射导致斑马鱼脑组织凋亡细胞增多，差异有统计学意义（P<0.05），照射组凋亡相关基因P53、P21、BBC3和炎症相关基因肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、环氧化酶-2(COX-2）、诱导型一氧化氮合成酶-2(INOS-2）的表达水平增多，差异有统计学意义（P<0.05)；照射后72h,P53的蛋白水平表达也显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：建立成年斑马鱼放射性脑损伤模型是可行的。

关键词：
凋亡
放射性脑损伤
斑马鱼
相关基因
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放射脑损伤机制及防治的研究需要一个稳定有效的动物模型。建立一个繁殖周期短、经济、大规模饲养所需空间小及可以进行广泛药物筛查的模型仍是目前的难点。此外，放射损伤还受单次剂量、分次数及剂量率的影响，影响模型的稳定性。斑马鱼放射脑损伤模型在国内外未见报道。本实验拟利用成年斑马鱼创建斑马鱼放射性脑损伤模型。

1、材料与方法

1.1试剂

Tunel红色凋亡检测试剂盒购自罗氏公司。DAPI，β-actin抗体和MS-222购自Sigma公司。P53抗体购自美国CST公司；RT-PCR转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒购自大连塔克拉生物公司。

1.2实验动物

实验采用斑马鱼为野生型AB系，3～6个月大小，不分雌雄，来自广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室，根据文献的方法饲养斑马鱼[1]。

1.3方法

1.3.1斑马鱼照射技术

80只成年斑马鱼随机分配到对照（Control）组与照射（RT）组。RT组剂量采用单次头部20Gy。照射时斑马鱼用0.01%MS-222麻醉，利用美国VARIAN2300EX直线加速器，使用6MVX线，源皮距100cm。

1.3.2Tunel法检测脑组织凋亡细胞

制作脑组织石蜡切片，按照试剂盒步骤进行Tunnel染色，接着进行DAPI染色，封片，光学显微镜计数并拍照。

1.3.3实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR)

获取脑组织RNA，测RNA浓度，逆转录合成cDNA。根据试剂盒说明及文献进行操作[2]。各基因的引物序列见表1。

1.3.4免疫印迹法检测P53蛋白水平

提取斑马鱼脑组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。实验方法参考文献[3]。

表1RT-PCR扩增斑马鱼相关基因的引物序列

1.4统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1放射导致斑马鱼脑组织出现凋亡增多

在照射后6h,RT组斑马鱼脑部切片中可以观察到明显的凋亡细胞，DAPI染色可观察到细胞出现核固缩、核破碎，Control组凋亡细胞不明显，见图1。在照射后24h,RT组脑组织出现凋亡细胞比照射后6h稍减少，见图2D、F,Control组未见明显凋亡细胞，见图2A、C。

2.2斑马鱼放射治疗后凋亡相关基因变化

放射治疗引起P53、P21和BBC3基因的表达显著增加，与Control组相比差异均有统计学意义（P<0.05），见图3。照射后72h,RT组P53蛋白水平较Control组显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

2.3斑马鱼放射治疗后炎症相关基因变化

放射治疗后，RT组肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2）和诱导型一氧化氮合成酶-2(induciblenitricoxidesynthase2,INOS-2）的基因表达水平较Control组显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

图16h后两组斑马鱼脑切片细胞凋亡情况（×200)

图224h后两组斑马鱼脑切片细胞凋亡情况（×200)

图3斑马鱼放射治疗后凋亡相关基因变化

图4斑马鱼脑组织P53蛋白变化情况

图5斑马鱼放射治疗后炎症相关基因变化

3、讨论

斑马鱼是一种基因组与人类高度同源的模式生物，与啮齿动物相比，斑马鱼具有以下优点：(1)产卵量大、发育快速，容易获得足够样本量；(2)饲养经济，成年鱼体积小，空间占用少，具备高通量筛查的条件；(3)胚胎透明，易于水体观察，动物产生的应激少，实验结果比较客观等[4]。国内外已建立多种斑马鱼实验疾病模型，包括斑马鱼幼鱼放射损伤模型[5]。

炎症在放射性脑损伤中起重要的作用。放射性诱导产生的炎症可以造成正常组织的持续损害。电离辐射中P53快速激活是共济失调毛细血管扩张突变蛋白质来介导的，并激活P53下游效应物（如P21）调节不同的反应。此过程依赖于P53介导的细胞周期阻滞和凋亡[6]。本研究照射斑马鱼引起的这些相关基因（TNF-α、IL-1β、COX-2等）的变化与啮齿类动物模型引起的放射脑损伤的基因变化类似[7,8]。

综上所述，应用成年斑马鱼建立放射性脑损伤模型是可行的。

参考文献：

[1]刘川,林春水,郭培培,等.胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露可下调髓鞘碱性蛋白的表达[J].南方医科大学学报,2018,38(9):1115-1120.

[2]罗招凡,郑上游,赵书琴,等.HNF1α基因克隆在不同分化程度胰腺癌细胞系中的表达[J].热带医学杂志,2018,18(8):1010-1013.

[3]任陈,杜莎莎.丹参酮ⅡA在体外对海马神经元细胞放射性损伤的保护作用[J].热带医学杂志,2017,17(5):588-591.

廖桂祥,龚龙,杨东,杨红丽,李先明,袁亚维.成年斑马鱼放射性脑损伤模型的建立[J].热带医学杂志,2020,20(08):1009-1012.