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电针改善大脑中动脉闭塞模型大鼠空间学习记忆的机制研究

2024-07-18 60 上传者：管理员

摘要：目的探讨电针对大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠空间学习记忆的影响及相关机制。方法 40只SD大鼠随机数字表法分为假手术组、模型组、电针穴位组、电针非穴组，每组10只。采用线栓塞法建立MCAO大鼠模型，电针穴位组给予电针百会和神庭，每次20 min，每天1次，治疗7 d，电针非穴组电针大鼠胁部以下，髂嵴以上10～15 mm非穴位处，余同电针组，假手术组和模型组仅给予同等时间的抓取和固定。观察各组大鼠神经行为学评分、水迷宫空间探索实验和定向巡航实验结果，正电子发射断层-X线计算机断层组合系统（PET-CT）检测大鼠海马区葡萄糖摄取率，蛋白质印迹法检测葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)表达水平。结果与模型组比较，电针穴位组大鼠干预第5、7天神经行为学评分显著降低[（1.55±0.51）分比（2.05±0.45）分，（1.30±0.47）分比（1.96±0.26）分，P均<0.05]；干预第3、4、5、6天逃避潜伏期明显缩短[（58.65±10.55）s比（86.18±15.86）s、（45.16±11.76）s比（73.89±14.85）s、（36.48±11.27）s比（63.23±13.87）s、（25.41±8.73）s比（50.77±11.57）s,P均<0.01]；穿越平台次数增加[（2.93±0.95）次比（1.53±0.53）次，P<0.01]；左/右侧海马区葡萄糖摄取率比值增加[（86.75±25.13）%比（80.28±24.00）%,P<0.05]；脑组织含水量减少[（78.27±0.60）%比（84.45±1.08）%,P<0.05]；左侧海马区GLUT1、GLUT3表达水平增加[（73.22±10.48）%比（56.39±12.21）%、（79.18±9.82）%比（58.37±16.07）%,P均<0.05]。与电针非穴组比较，电针穴位组大鼠干预第5、7天神经行为学评分显著降低[（1.55±0.51）分比（2.03±0.45）分、（1.30±0.47）分比（1.82±0.47）分，P均<0.05]；第3、4、5、6天逃避潜伏期明显缩短[（58.65±10.55）s比（84.48±14.36）s、（45.16±11.76）s比（70.78±13.93）s、（36.48±11.27）s比（59.94±11.02）s、（25.41±8.73）s比（48.97±10.44）s,P均<0.01]；穿越平台次数增加[（2.93±0.95）次比（1.63±0.50）次，P<0.01]；左/右侧海马区葡萄糖摄取率比值增加[（86.75±25.13）%比（81.87±25.67）%,P<0.05]；脑组织含水量减少[（78.27±0.60）%比（82.44±0.40）%,P<0.05]；左侧海马区GLUT1、GLUT3表达水平增加[（73.22±10.48）%比（58.57±8.74）%、（79.18±9.82）%比（62.10±9.98）%,P均<0.05]。结论电针百会和神庭可能通过调节GLUT1和GULT3的表达改善MCAO模型大鼠脑内葡萄糖代谢水平，从而改善其空间学习记忆能力。

关键词：
大脑中动脉闭塞
脑梗死
葡萄糖代谢
葡萄糖转运蛋白1
葡萄糖转运蛋白3
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脑卒中是一种常见的脑血管意外，是成人致死致残的重要原因[1]。幸存的脑卒中患者约有1/3会出现认知障碍，严重影响患者的身心功能和日常生活[2]。电针作为一种有效、简单、方便和廉价的治疗方法，已被广泛应用于治疗脑卒中后的认知障碍（PSCI）。百会和神庭是治疗PSCI常用的穴位[3]，然而电针百会、神庭治疗PSCI的机制尚未完全阐明。大脑神经元的活动主要依赖脑内葡萄糖代谢产生的三磷酸腺苷（ATP）提供能量，而葡萄糖进入脑内需要葡萄糖转运蛋白1(GLUT1）和葡萄糖转运蛋白3(GLUT3）的转运[4]，因此葡萄糖代谢紊乱被认为是学习记忆等大脑功能障碍的物质基础。本研究拟以大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠为研究对象，探讨电针百会和神庭对MCAO模型大鼠的脑保护作用以及海马区葡萄糖代谢的影响，并进一步采用蛋白质印迹法探究海马区GLUT1和GLUT3的表达。

1、材料与方法

1.1 动物

成年雄性Sprague-Dawley(SD）大鼠，体质量250～280 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。大鼠饲养于清洁级动物房内，温度保持21～25℃，湿度保持60%～70%，日间和夜间各12 h交替。本研究通过温州医科大学附属丽水二院伦理委员会批准，伦理批件号：20190606-02。

1.2 主要试剂和仪器

GLUT1一抗（批号ab652）和GLUT3一抗（批号ab41525）购自Abcanm公司。β-肌动蛋白（β-actin）一抗（批号HC201-01）、羊抗兔二抗（批号HS101-01）购自北京全式金生物技术有限公司。异氟烷（批号20220101）购自深圳瑞沃德生命科技有限公司。四唑红2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（批号T8877-100G）购自SIGMA公司。正电子发射断层-X线计算机断层组合系统（PET-CT）（型号vector+）购自荷兰MILABS公司。Image-lab图像分析系统（型号1708265）购自美国BIO-RAD LABORATORIES公司。Morris水迷宫购自中国医学科学院药物研究所。电针仪（型号SDZ-V）购自苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 分组

50只大鼠按照随机数字表法分为假手术组10只和手术组40只；手术组建立MCAO大鼠模型，共造模成功30只，按照随机数字表法分为模型组、电针穴位组和电针非穴组，各10只。

1.4 造模和干预

参照课题组之前的研究制备MCAO模型[5]，手术组40只SD大鼠用5%异氟烷麻醉后，切开颈部皮肤分离左颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和左颈内动脉（ICA），将ECA系结，从CCA插入制备好的鱼线，最终至左侧大脑中动脉，插入长度为距颈动脉分叉处18～22 mm。缺血2 h后，取出鱼线进行再灌注。假手术组只分离左侧CCA、ECA和ICA，但不插入鱼线。电针穴位组电针百会和神庭，穴位定位参照《实验针灸学》[6]，选用华佗牌0.5寸豪针，斜刺入2～3 mm，接电针仪，电流强度1～3 m A（以针体轻轻抖动为度），选用疏密波（频率2/10 Hz），每天电针干预1次，每次20 min，共7 d，于术后24 h开始。电针非穴组取大鼠胁部以下，髂嵴以上10～15 mm非穴位处2处，向下斜刺5 mm，余治疗同电针穴位组。假手术组和模型组大鼠不进行电针干预，只进行同等时间的抓取和固定。

1.5 神经行为学评分

采用Zea-longa神经行为学评分[7]，于干预第1、3、5、7天对各组大鼠神经功能缺损情况进行评价。0分，无神经功能缺损体征；1分，提尾时右侧前爪屈曲不能完全伸展；2分，行走时向偏瘫侧转圈；3分，行走时向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。

1.6 水迷宫实验

在干预的第3～7天，进行水迷宫实验以测试大鼠空间学习和记忆能力。将直径为200 cm的圆形水迷宫装置充满水，将直径为6 cm的透明平台浸没在2 cm深度的水中。在实验正式开始前，分别让各组大鼠于水池中自由游泳2 min，以适应实验环境。第3～6天进行定位航行实验，将各组大鼠从第1象限到第4象限，面向池壁放入水池。如果大鼠在90 s时限内发现平台并在其上停留3 s，则记录到达平台所花费的时间为逃避潜伏期。如果不能在90 s内找到平台，则记录潜伏期为90 s，将大鼠放置在平台上10 s进行学习。第7天进行空间探索实验，将平台从水迷宫中移除，观察大鼠在90 s内通过平台先前所处位置的次数。

1.7 海马区葡萄糖摄取率检测

每组随机取6只大鼠在干预结束后禁食12 h，用5%异氟烷麻醉，于尾静脉注射（20±1.84)MBq氟[18F]脱氧葡萄糖（Fludeoxyglucose[18F],18F-FDG），将大鼠置于扫描床，进行正电子发射计算机断层显像（PET）扫描，参数为能量峰450～550 ke V，窗宽±20%,30 min/帧，完成84次投射。最后进行CT扫描，参数为电压55 ke V，电流615μA。总共采集时长为15 min。图像重建和数据处理方法：PET图像重建通过POSEM程序完成，CT图像重建通过椎体束滤波反投影算法完成。在完成图像重建后，通过register程序，将PET数据与CT数据进行匹配后得到新的PET-CT图像，将图像与脑图谱模板进行融合，计算出大脑各个脑区18F-FDG的标准摄取值，最后计算出两侧半球海马区葡萄糖摄取率的比值。摄取率比值=左侧海马区葡萄糖摄取率/右侧海马区葡萄糖摄取率×100%。

1.8 脑组织含水量测定

每组随机取4只大鼠完整的脑组织，用锡箔纸包裹，称得大鼠脑组织的湿重。将锡箔纸包裹的脑组织，放入110℃烤箱中连续烘烤24 h，再次称重，称得的质量为干重。脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.9 GLUT1和GLUT3表达水平检测

取左侧海马组织置液氮罐中速冻，-80℃冰箱保存。取海马组织100 mg，加裂解缓冲液1 m L和苯甲基磺酰氟10μL，充分研磨后离心，取上清。BCA蛋白浓度法测定蛋白浓度。样品蛋白变性后，取样品蛋白50μg,12%SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜，封闭液封闭2 h，分别用GLUT1、GLUT3、β-actin一抗（1∶1 000）孵育，4℃过夜，用辣根过氧化物标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。将PVDF膜放图像扫描仪上，避光配置显色液并覆盖PVDF膜，Image-lab图像分析系统进行分析。

1.1 0 统计学方法

应用SPSS 25.0统计软件进行分析，数据符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示，多组数据两两比较采用单因素方差分析，方差齐者用LSD法，方差不齐则用Games-Howell法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 电针百会和神庭对MCAO模型大鼠神经功能缺损的影响

与模型组和电针非穴组比较，电针穴位组大鼠第5、7天神经行为学评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠神经行为学评分比较

在定位航行实验中，与模型组和电针非穴组比较，电针穴位组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P<0.01），见图1和表2。在空间探索实验中，与模型组和电针非穴组比较，电针穴位组大鼠穿越平台次数明显增多，差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

图1 各组大鼠定位航行实验游泳轨迹的代表性图片

2.3 电针百会和神庭对MCAO模型大鼠左/右侧海马区葡萄糖摄取率比值的影响

与模型组和电针非穴组相比，电针穴位组大鼠左/右侧海马区葡萄糖摄取率比值增高，差异有统计学意义（P<0.05），见图2和表4。

2.4 电针百会和神庭对MCAO模型大鼠脑组织含水量的影响

与模型组和电针非穴组相比，电针穴位组大鼠脑组织含水量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

2.5 电针百会和神庭对MCAO模型大鼠GULT1和GLUT3表达的影响

与模型组和电针非穴组相比，电针穴位组大鼠左侧海马区GULT1和GLUT3表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图3和表6。

3、讨论

PSCI患者常表现为学习记忆受损，甚至影响患者的肢体功能恢复和日常生活活动能力。针刺用于改善PSCI患者的认知功能，已获得越来越多的认可[8]。PSCI归属于中医“健忘”“善忘”等症，属于神志病范畴，病位在脑，其本在肾，和其他脏腑关系密切。“病变在脑，首取督脉”[9]，百会和神庭皆是督脉上的穴位，临床常用于治疗PSCI。王倩文等[10]通过数据挖掘探究针刺治疗PSCI的选穴规律，结果发现针刺治疗PSCI以头部腧穴治疗为主，其中百会和神庭是常用的穴位。前期研究也发现针刺百会和神庭可以改善PSCI[11]。本研究显示，电针百会和神庭可以改善MCAO模型大鼠的神经行为学评分，减轻脑组织水肿，缓解大脑功能的损伤，改善MCAO模型大鼠的空间学习记忆能力，这也和李鹏飞等[12]的研究结果相一致。

大脑学习记忆等神经元功能的发挥都需要以能量代谢产生的ATP为物质基础，葡萄糖是脑内神经元主要的能量来源，因此葡萄糖代谢提供的能量对神经元突触可塑性等功能发挥有着重要的作用[13],PET-CT可以在活体上直接观察脑组织的葡萄糖代谢情况，研究发现电针可以改善MCAO模型大鼠脑区的葡萄糖代谢，改善脑梗死体积[14]，这和本研究结果相一致。转运蛋白是脑内葡萄糖运输必不可少的运载工具，葡萄糖通过GLUT1的运送通过血脑屏障[15]，依赖GLUT3的转运进入细胞内[16]，二者在葡萄糖的吸收和利用过程中起着至关重要的作用。本研究结果显示，电针百会和神庭可以改善MCAO模型大鼠GLUT1和GLUT3蛋白的表达，从而改善海马区的葡萄糖代谢。

表2 各组大鼠逃避潜伏期比较

表3 各组大鼠穿越平台次数比较

图2 各组大鼠脑组织葡萄糖摄取情况（×400)

表4 各组大鼠左/右侧海马区葡萄糖摄取率比值比较

表5 各组大鼠脑组织含水量比较

图3 各组大鼠左侧海马区GULT1、GLUT3蛋白印迹图

表6 各组大鼠左侧海马区GLUT1、GLUT3表达水平比较

综上所述，本研究结果显示，电针百会和神庭可改善MCAO模型大鼠空间学习记忆能力，其机制可能与调节GLUT1和GLUT3蛋白的表达从而改善海马区葡萄糖代谢相关。

参考文献:

[1]王陇德,彭斌,张鸿祺,等.《中国脑卒中防治报告2020》概要[J].中国脑血管病杂志,2022,19(2):136-144.

[3]刘芳,姚立群,陈金辉.针刺百会､神庭穴治疗脑卒中后认知功能障碍效果的系统评价[J].上海针灸杂志,2018,37(1):104-111.

[5]俞坤强,林如辉,陶静,等.电针对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及MMP-2､MMP-9蛋白表达的影响[J].中国康复医学杂志,2015,30(11):1095-1099.