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一个Ⅰ型神经纤维瘤家系的全外显子组测序分析及产前诊断

2023-06-26 147 上传者：管理员

摘要：目的探讨一个Ⅰ型神经纤维瘤家系的遗传学病因，并为该家系的孕妇进行产前诊断，为遗传咨询和预后评估提供参考依据。方法采用高通量测序技术对先证者、先证者母亲及先证者配偶进行全外显子组测序（WES），鉴定与先证者临床表型相关的候选基因变异，采用Sanger测序对候选基因变异进行验证，并对胎儿进行产前诊断。结果先证者、先证者母亲以及先证者胎儿均检出NFⅠ基因的c.6711del(p.Vla2238Cysfs*6)杂合变异，先证者配偶未检出该变异。该变异为未见报道的新变异，被评估为致病性变异。结论本研究采用WES的方法为一个Ⅰ型神经纤维瘤家系确定了遗传学病因，所发现的NFⅠ基因变异未见报道，扩充了NFⅠ基因变异谱。

关键词：
Ⅰ型神经纤维瘤
产前诊断
全外显子组测序
基因变异
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Ⅰ型神经纤维瘤（neurofibromatosis typeⅠ，NFⅠ）是一种以牛奶咖啡斑和神经纤维瘤为主要临床特征的常染色体显性遗传病。NFⅠ在活产儿中的发病率约为1/3500[1]，其致病基因为NF1(OMIM ID:613113），该基因定位于染色体17q11.2，总长为282751 bp，目前已知有3种剪接方式，其中最长的转录本1 (NM＿001042492.3）含有58个编码外显子，编码的NF1蛋白包含2839个氨基酸。但在人类中主要表达的转录本是转录本2(NM＿000267.3），该转录本比转录本1少一个外显子，导致其所编码的蛋白质缺少21个氨基酸。NFⅠ是一种抑癌基因，该基因的突变可导致蛋白质的功能丧失，使患者体内Ras活性增加，细胞过度增殖[2,3]，从而导致患者出现一系列NFⅠ相关的症状。目前，基因检测是辅助遗传病诊断的重要的手段。然而，由于NFⅠ基因较大，其外显子较多，且缺乏热点突变，所以，传统的Sanger测序费时费力。近年来，随着高通量测序技术

在临床上广泛应用于遗传病的基因诊断，采用目的基因捕获高通量测序或全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）的策略，可一次性捕获NFⅠ基因编码区所有外显子及其部分侧翼序列，进行高通量测序，从而帮助NFⅠ实现快速、准确的基因诊断。本研究采用WES对一个Ⅰ型神经纤维瘤家系进行基因突变分析，并为先证者胎儿进行产前诊断，为遗传咨询和预后评估提供指导。

1、研究对象与方法

1.1 研究对象

先证者为女性，31岁，就诊于南宁市第一人民医院，出生时发现手臂、后背及大腿存在牛奶咖啡斑，青春期开始出现散在的皮下纤维瘤，且随着年龄的增长进行性加重（图1）。先证者的生长发育以及智力言语等均正常。先证者外公、母亲、舅舅和妹妹均有牛奶咖啡斑和神经纤维瘤等症状，其父亲未见相关症状，详细家族史见图2A。依照NIH诊治的标准[4]，先证者以及家族中携带着相似的临床特征的成员均可诊断为Ⅰ型神经纤维瘤。

1.2 标本采集与基因组DNA提取

本研究经南宁市第一人民医院伦理委员会批准（伦理号：2022-102-01），并与受试者签署临床研究知情同意书后，采集先证者、先证者母亲及先证者配偶的静脉血标本。由于先证者的父亲、祖父和叔叔去世，故无法采集标本。采用血液DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司），根据标准操作流程提取静脉血标本中的基因组DNA。同时，经羊膜穿刺术抽取先证者的羊水标本10 m L，采用微量样本基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]从羊水中提取基因组DNA。

1.3 WES检测及生物信息分析

本研究对先证者、先证者母亲和先证者配偶的基因组DNA进行了WES检测，WES检测和生物信息分析由北京贝瑞和康生物技术有限公司完成。WES实验过程如下：首先采用超声波振荡仪将基因组DNA随机打断至约350 bp的片段，然后对DNA片段进行末端修复，再加入A尾，连接Illumina测序通用接头。采用全外显子杂交捕获探针x Gen Exome Research Panel V2 of Integrated DNA Technologies (IDT)富集人类全外显子DNA片段，构建高通量测序文库。最后采用Illumina Novaseq平台进行双末端高通量测序。测序获得的Fastq原始数据通过GATK(v3.6)、XHMM (v1.0)等软件分析拷贝数变异、单核苷酸变异和小的插入与缺失。依据在线人类孟德尔遗传数据库（http://www.omim.org/）、人类基因突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/validate.php）、db SNP(http://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.bjmu.ilibs.cn/snp/?term=）、千人基因组计划和Gnom AD (http://gnomad-sg.org/）等数据库对检出的基因变异进行注释，在各数据库中均未发现的变异定义为未见报道的新变异。

1.4 Sanger测序和致病性评估

针对WES检出的与先证者临床表型相关的可疑NFⅠ基因变异，在UCSC数据库中获得其附近序列（NM＿000267.3），通过Primer 3在线软件（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计PCR扩增引物，引物序列如下：上游5'-GCTGGACCAGTGGACAGAAC-3'，下游5'-TTTCA-TTGACCTCAAATTTAAACG-3'，引物序列提交给生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。针对家系成员中所采集的基因组DNA，采用Premix Taq™试剂（日本Ta Ka Ra公司，货号：RR901A）进行PCR扩增，PCR扩增采用25µL体系进行：包含12.5µL Taq DNA聚合酶混合液，10 mmol/L的上下游引物各1µL,2µL模板DNA以及8.5µL dd H2O。使用琼脂糖凝胶（浓度为1.5%）对PCR扩增终产物进行电泳分析，电泳合格的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。Sanger测序结果采用Chromas 2.6.5软件进行分析。对于经过WES和Sanger检测为明确的基因畸变，按照美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）分子病理学协会（Association for Molecular Pathology,AMP）关于基因变异致病性的评估指南[5]，评估候选基因变异的致病性。

2、结果

经WES检测、生物信息分析、临床表型对照分析和Sanger测序验证，先证者及其母亲NFⅠ基因（NM＿000267.3）第44号外显子检出c.6711del杂合变异，先证者配偶未检出该变异（见图2B）。该变异可导致第2238位氨基酸由缬氨酸变为半胱氨酸，并提前终止（p.Vla2238Cys fs*6），产生一个只有2243个氨基酸的截短蛋白，比正常蛋白减少了575个氨基酸，且缺失的氨基酸序列中包括重要的核定位序列（nuclear localization sequence,NLS），因此，该变异可能为功能丧失型（loss of function）变异（PVS1）。同时，该变异在千人基因组、db SNP、gnom AD数据库以及Clin Var、HGMD等数据库中均未见报道，为新变异（PM2）。此外，根据NFⅠ的临床诊断标准[4]，先证者的临床症状与NFⅠ较为符合（PP4）。该变异可被评估为致病性变异（PVS1+PM2+PP4）。最终，该变异可确定为先证者的遗传学病因，进一步采用Sanger测序对先证者的胎儿进行产前诊断，结果显示先证者胎儿检出c.6711del杂合变异。

3、讨论

NFⅠ是目前最常见的常染色体显性遗传病之一，患者的临床表现具有极大的多样性和异质性，临床上的诊断较为困难。目前常用的NFⅠ的诊断标准是美国国立卫生研究院于1988年制定的，该诊断标准共对七方面的临床症状进行评估，当患者的临床特征符合其中两条或两条以上即可确诊为NFⅠ[4]。NFⅠ最典型的临床特征为牛奶咖啡斑和神经纤维瘤[6]，其中牛奶咖啡斑通常是NFⅠ最早出现的临床症状，一般在婴儿早期即可出现。而神经纤维瘤则是NFⅠ患者最常见的临床特征，多在青春期出现[7]。本研究的家系中，先证者及其母亲均存在不同程度的牛奶咖啡斑和神经纤维瘤，并且均检出相同的致病性NFⅠ基因变异，而表型正常的先证者丈夫未检出该变异，因此，临床特征和基因检测均符合NFⅠ的诊断，所检出的c.6711del(p.Vla2238Cys fs*6)变异为该家系的遗传学病因。经过遗传咨询和知情同意后，抽取先证者的羊水，针对该基因变异进行了产前诊断，结果发现胎儿存在相同的基因变异，考虑到该病为非致死性遗传病，先证者选择继续妊娠。目前，胎儿已经出生，随访至文稿发出时，已有3月龄，但尚未出现NFⅠ症状，可能是因为其年龄尚小，也有可能是由于胎儿体内存在某些特殊的修饰因素，如性激素、遗传因子及肿瘤微环境等[8]，所以，胎儿尚未表现出相关临床特征。

图1 先证者典型临床表现

图2 Ⅰ型神经纤维瘤家系图和Sanger测序图

人类NFⅠ基因的突变率非常高，比大多数其他遗传病致病基因[9]的突变率高出10倍以上。截至2022年2月，专业版的HGMD数据库已收录了3800多个NFⅠ基因变异，主要包括错义变异、无义变异、剪接变异、微小插入与缺失变异、大片段插入与缺失等。目前发现的NFⅠ基因变异散在分布于该基因的各个区域，尚未见热点突变或区域[10]。绝大多数的NFⅠ基因变异可引起m RNA和（或）蛋白质的缺失，从而导致蛋白质的功能丧失[11]。本研究通过WES和Sanger测序，发现先证者及其母亲NFⅠ基因第44号外显子存在一个未见报道的缺失变异c.6711del(p.Vla2238Cys fs*6)，可编码产生一个截短蛋白。

NFⅠ蛋白主要包括N端的半胱氨酸丝氨酸富集区（CSRD，第543～909位氨基酸）、GTP酶激活蛋白功能区（GRD，第1095～1530位氨基酸）、Sec14同源区和pleckstrin同源区（Sec PH，第1550～1816位氨基酸）以及C端（CTD，第2260～2818位氨基酸）等四个结构域。因此，c.6711del变异可导致NFⅠ蛋白丢失包括NLS在内的整个C端结构域。研究显示[12]，大多数导致疾病发生的NFⅠ基因变异为截短变异（truncating variant），可形成缺乏重要功能域的截短蛋白，也可能导致无义介导的m RNA降解（nonsense-mediated m RNA decay,NMD），从而影响患者体内的NFⅠ蛋白的正常合成，导致NFⅠ蛋白剂量不足，从而促使疾病的发生。

综上，本研究利用WES，为一个疑为NFⅠ的家系进行基因检测和产前诊断，鉴定了NFⅠ基因一个未见报道的新变异c.6711del(p.Vla2238Cys fs*6)，在基因水平上明确了NFⅠ的诊断，为该家系中已出生胎儿的临床表型预测以及其他成员的遗传咨询提供了有效的依据。同时，新变异的发现也拓展了中国人群NFⅠ基因突变谱。

参考文献：

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文章来源：张晓敏,陈琪瑛,黄慧英等.一个Ⅰ型神经纤维瘤家系的全外显子组测序分析及产前诊断[J].中国优生与遗传杂志,2023,31(06):1229-1232.