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通过外显子测序技术对1例孤独症谱系障碍患者的致病基因分析

2020-08-10 572 上传者：管理员

摘要：目的：应用外显子测序技术对1例孤独症谱系障碍的男童进行外显子组测序分析,寻找致病基因。方法：选择1例就读于自闭症特殊学校的5岁男童,收集其临床资料,提取外周静脉血DNA,应用Nimblegen外显子序列捕获芯片及高通量测序技术对外显子区域进行测序。结果：通过全外显子组捕获测序发现了非同义突变11309个,移码突变365个,同义突变23075个,其中发现有4个基因的突变已有文献报道可能与孤独症谱系障碍的发病有关,这4个基因包括PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM。结论：应用外显子组捕获测序对该例孤独症谱系障碍的男童进行测序分析显示,大量单核苷酸多态性可能与该病的发生有关,也进一步证实了PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM这4个基因可能与孤独症谱系障碍的发生有关,有待进一步大样本研究及实验室研究验证其在孤独症谱系障碍发病中的具体机制。

关键词：
儿科
全外显子组捕获测序
基因突变
孤独症谱系障碍
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孤独症谱系障碍，是一种以社会交流和交往障碍、狭隘的兴趣及重复刻板行为为主要表现的神经发育性疾病[1]，困扰着全世界约1%～2%的儿童，并且发病率逐年上升[2,3]。至今ASD的致病机制尚未明确，导致对其采取积极的预防手段受限，目前针对ASD治疗手段也比较单一，因此造成巨大的社会和经济负担。近年来研究显示遗传因素在ASD的发病中起重要作用[4,5,6]。近几年外显子组测序和全基因组测序已成为检测基因突变的重要手段，目前至少有几百个基因变异被发现可能与ASD的发病相关[2,7,8,9,10],这为将来从基因水平预防、诊断ASD提供可能。本研究通过全外显子组测序技术，明确1例具有典型孤独症谱系障碍表型的患儿的致病基因。

1、对象与方法

1.1研究对象

患儿,男,5岁3个月。父母表型和智力均正常,非近亲婚配。生育患儿时，父33岁、母24岁,母孕期无特殊。患儿系G1P1,胎龄33周、顺产,妊娠和分娩正常,出生体重2.25kg。否认自闭症家族史、语言发育迟缓、智力障碍或癫痫发作等病史。现就读于自闭症特殊学校。患儿母亲签署了知情同意书,本研究得到了西南交通大学附属医院成都市第三人民医院伦理委员会审查并批准。

1.2研究方法

1.2.1临床评估

(1)儿童神经内科副主任医师对患儿进行全身详细体格检查;(2)儿童精神科副主任医师依据精神疾病诊断与统计手册第5版(DSM-V)标准对患儿进行精神评估;(3)儿童精神科副主任医师通过完成孤独症诊断观察量表(ADOS,M2)、孤独症行为评定量表(ABC)及婴幼儿孤独症筛查量表(M-CHAT)对患儿进行孤独症样行为症状评定。

1.2.2外显子组捕获测序

抽取患儿外周静脉血1ml,存放于EDTA抗凝管中，在短时间内用Axygen外周血DNA提取试剂盒提取gDNA，提取过程及方法严格按照说明书进行。提取的gDNA原液使用NanDrop分光光度计检测其浓度，然后根据A260/A280的比值判断其纯度。合格的gDNA样本送至晶能生物技术（上海）有限公司，应用Nimblegen外显子序列捕获芯片与高通量测序技术对外显子区域进行测序，通过制备DNA-seq文库、芯片杂交洗脱、捕获后DNA-seq文库的扩增及质检完成样品制备，建好的DNA-seq数据库通过Illumina测序系统（IlluminaHiseq3000测序系统，美国Illumina公司）获取外显子序列,用Picard数据处理测序所得数据，用ANNOVAR数据分析遗传突变,进一步使用炎黄、千人基因组等数据库去掉冗余单核苷酸多态性位点[11,12,13,14]（如图1所示）。

图1全外显子组捕获测序的技术路线

2、结果

2.1临床评估

体检结果如下：患儿5岁3个月,体重22kg,身高118.5cm,头围51.3cm。神志清楚,无特殊面容，目光对视差,表情少。双眼无斜视及眼震。心脏、双肺及腹部查体均未见明显异常。四肢外观未见畸形,未见异常运动模式，四肢肌张力正常。神经系统查体未见异常。精神评估结果显示患儿完成测评任务配合度差，最终没能完成所有分项的测验，在整个评估过程中，患儿存在明显的社会交往及沟通障碍,难以配合完成社会交往能力检查。测评中患儿有瞬间的目光对视,但却没有目光交流及视线追随。在孤独症诊断观察量表(ADOS,M2)测试中,患儿在沟通方面几乎没有口语表达能力，对测评医师的问题也未作相应回应，无明显“鹦鹉学舌”的表现。进行非语言交流评估时,患儿没有出现具有指向的手势或运用日常常见的其他的手势。进行社交评估时，他人呼其名时患儿无任何反应，基本没有社会交往能力。刻板重复行为方面，观察过程中未见患儿有明显刻板重复行为。孤独症行为评定量表(ABC)结果如下：感觉能力项目得分14分、交往能力项目得分26分、运动能力项目得分18分、语言能力项目得分25分、自我照顾能力项目得分13分，总分96分，结果阳性，符合孤独症谱系障碍的诊断。婴幼儿孤独症筛查量表(M-CHAT)结果如下：高危项目1项，任意项目7项，阳性结果，与孤独症谱系障碍的表现相符。

2.2外显子组测序结果

通过应用全外显子组捕获测序技术，我们发现该病例中，非同义突变11309个，移码突变365个，同义突变23075个，其中有4个基因的突变是已报道的，且都为非同义突变，这4个基因包括PTEN[15,16]、AFF2[17]、LAMB1[18]、NRCAM[19]（如表1所示）。

3、讨论

本研究发现该患儿基因中有1万余个非同义突变，这些突变都有可能与该病的发生有关，且在这些突变中，目前PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM这4个基因已经被相关文献[15,16,17,18,19]报道可能与ASD的发生相关。PTEN是一种肿瘤抑制基因，该基因的突变已被证实与神经系统疾病发生有关，目前研究表明PTEN的突变是mTOR信号通路的负调控因子，影响神经细胞的生长和增殖[20],PTEN突变的个体容易发生大头畸形、ASD和智力障碍等神经发育相关疾病，目前ChenCJ等[21]研究发现mTORC2活性的缺失可以延长Pten缺乏小鼠的寿命，改善孤独症样行为，并使其大脑代谢变化正常化，这为临床治疗相应ASD病例及进一步从信号通路水平研究疾病机制提供了思路。AFF2突变早期被发现与脆性E智力低下发生相关，几年来被发现与智力低下相关的疾病如ASD也有关，MondalK[17]等研究报道AFF2突变者的ASD患病风险增加了4倍以上，这与ASD男女患病比相似，可能是解释男女ASD患病的差异机制之一。LAMB1是编码层粘连蛋白的基因，有利于促进神经细胞的迁移和神经突的生长[22]，有研究[23]发现LAMB1在海马神经元中表达水平较高，这可能与ASD儿童智力发育迟缓的发病机制有关。NRCAM在神经系统发育中发挥重要作用,参与轴突的生长、突触形成过程,被发现与ASD、药物成瘾、阿尔茨海默病等神经精神疾病有关[24]。以上基因都与神经的发生密切相关，其突变可导致不同临床表型的ASD。

ASD具有明显的遗传异质性，发病相关的风险基因众多，使高价值靶点的识别复杂化，很多研究认为ASD致病可能存在一些共同生物学途径，目前发现基因突变后引起wnt信号通路、Ca2+信号通路、mTOR信号通路等的失常是ASD发病的潜在机制[25]，了解基因突变针对的生物学途径有望找到ASD潜在的药理干预靶点。然而在本病例中虽然发现4个与ASD相关的基因突变，但具体是哪些基因在患儿发病中起重要作用却难以确定，为了解决ASD高度遗传异质性带来的临床难题，郭辉等人[26]曾提出将ASD遗传学的研究方向着点于基因型-表型关联研究，即表型到基因型与从基因型到表型两方面进行关联性研究，这有利不同临床亚型孤独症患者在有药可医的将来能得到个体化治疗。

本研究中发现PTEN、AFF2、LAMB1、NRCAM等基因与孤独症的发生可能相关，有待增加研究样本量并深入研究其在ASD发病中的具体机制。ASD的发病机制较为复杂，目前外显子组测序手段的发展使ASD遗传学研究尤其是在新发突变上的发现取得了新的进展[27]，有望对ASD儿童进行亚组分型进一步阐明ASD的遗传机制使其早期临床检测和遗传咨询成为可能。在今后的临床工作中，对于ASD患儿可以将外显子组测序手段作为一线辅助检测手段，这有利于建立孤独症相关致病基因基因库，继而从这些基因突变的机制中找到靶向治疗ASD的方法。

参考文献：

[26]郭辉,胡正茂,夏昆.孤独症的遗传病因学研究进展及基因型-表型关联研究计划[J].生命科学,2014,26(6):571-582.

[27]张宏,杜亚松.孤独症谱系障碍的遗传学研究进展[J].精神医学杂志,2015,28(6):467-470.

黄丽,李佳敏,朱华,李桦,李红霞,许文明,谢江.通过外显子组测序对1例孤独症谱系障碍患者的致病基因分析[J].现代预防医学,2020,47(12):2242-2245.

基金:四川省科技厅科研项目(2016JY0185);四川省卫生健康委员会科研课题(19PJ009).