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新一代测序技术在3例Waardenburg综合征患儿中的应用

2021-09-29 94 上传者：管理员

摘要：目的:应用新一代测序技术对临床确诊为Waardenburg综合征（WS）的3例患儿进行基因检测,探讨可能的分子遗传学机制。方法:对通过病史采集、全身及耳科查体、听力及影像学检查确诊为WS的3例患儿,采用新一代测序技术检测耳聋相关的159个基因的外显子区,6个线粒体基因,3个miRNA,得到可能的致病基因突变位点后,再对先证者的家属进行Sanger测序验证。结果:第1例先证者MITF基因（NM000248）7号外显子出现1个杂合突变:c.641643delGAA;第2例先证者MITF基因（NM001354605）10号外显子出现1个杂合突变:c.1177-1G>A;第3例先证者PAX3基因（NM181457）5号外显子出现1个杂合突变:c.587593delCCTCAGC;3例先证者父母通过Sanger测序验证相应位点均无变异,以上突变均为自发突变。结论:新一代测序技术能够分析WS家庭致病基因的携带状况和遗传规律等信息,对家庭再生育进行指导。

关键词：
Waardenburg综合征
基因
应用
新一代测序技术
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遗传性聋中30%为综合征性耳聋[1],除听力下降表型外还伴随其他临床表现。目前已发现400多种伴有耳聋的综合征[2]。其中Waardenburg综合征是一种罕见的综合征性耳聋，又称听力-色素综合征，以感音神经性聋及虹膜、毛发和皮肤异色为主要特征[3]。WS的人群发病率为1/212000,但由于该综合征临床和遗传上的异质性，不完全外显率达20%,故推测实际人群发病率为1/42000,占先天性聋人群的0.9%～2.8%[4]。WS多为显性遗传[5],根据不同的临床表现分为4型[6]:WS1表现为先天性感音神经性聋，内眦异位、色素异常；WS2与WS1相似，但无内眦异位；WS3除了WS1临床表现外，常合并上肢异常；WS4除了WS2临床表现外，可合并胃肠道结构畸形。4型中以WS1和WS2最为多见。已证实有7种基因与WS有关：PAX3、MITF、SNAI2、EDNRB、EDN3、SOX10和KITLG[7]。

1、资料与方法

1.1临床资料

2018年1月—2019年1月于我科确诊的3例WS患儿，男1例，女2例；年龄分别为1岁、2岁1个月和6岁。收集先证者和家属的临床资料，完善全身相关体格检查。测量先证者内眦距离(A)、瞳孔距离(B)及外眦距离(C),计算W值{X=[2A-(0.2119C+3.909)]/C,Y=[2A-(0.2497B+3.909)]/B,W=X+Y+(A/B)}。临床听力学检测包括行为测听、声导抗、耳声发射(OAE)、听觉脑干诱发电位(ABR)、多频稳态诱发电位(ASSR),根据1997年WHO听力损失程度分级标准：≤25dBHL为正常，26～40dBHL为轻度，41～60dBHL为中度，61～80dBHL为重度，≥81dBHL为极重度耳聋。颞骨CT和头颅MRI检查，对3例患儿进行新一代测序技术，得到可能致病基因突变位点后，再对先证者家属进行Sanger测序验证。该研究经我院医学伦理委员会批准，基因检测取得患儿家属的同意并签署知情同意书。

1.2基因检测流程

1.2.1建立病例档案

详细记录患儿的一般信息，听力情况，出生情况，既往史，家族史，外伤手术史，用药史等。

1.2.2基因测序

先证者采用新一代测序技术进行检测，发现可疑突变基因，再对其家属进行Sanger测序验证。①目标区域捕获测序：基因捕获策略选择已知的耳聋候选159个基因的外显子区，6个线粒体基因，3个miRNA进行捕获。将基因组DNA随机打断成片段，与IlluminaPE接头寡核苷酸混合物链接，对产物进行链接介导的聚合酶链式反应(LM-PCR)扩增纯化后得到DNA文库，并对其进行质量检测，将上述PCR产物与目标区域捕获芯片进行杂交以富集目标区域序列，借助IlluminaNext500新一代测序平台对捕获的序列进行测序，并对原始数据进行图像识别和样本区分。②数据分析：去除测序数据中的接头序列和低质量数据，然后利用BWA软件将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列(hg19)上，利用GATK软件分析得出单核苷酸变异(SNP)和插入缺失突变(INDEL)的相关信息。通过ANNOVAR软件对所有的SNP和INDEL进行注释，筛选掉正常人数据库P<5%的突变位点。③一代测序验证：得到的获选变异位点利用PCR和Sanger测序验证，再在家系成员中进行共分离验证。

2、结果

1例先证者MITF基因(NM_000248)7号外显子出现1个杂合突变：c.641_643delGAA;1例先证者MITF基因(NM_001354605)10号外显子出现1个杂合突变：c.1177-1G>A;1例先证者PAX3基因(NM_181457)5号外显子有1个杂合突变：c.587_593delCCTCAGC;3例先证者父母通过Sanger测序验证相应位点均无变异，以上突变均为自发突变。

3、病例报告

先证者1女，2岁1个月。出生时听力筛查未通过，1个月后复筛未通过，其后未进行听力检查，2岁时仍不会诉简单词汇，就诊于我院，否认耳聋家族病史和耳聋药物服用病史。查体：双侧虹膜呈亮蓝色，头发细黄(图1a),无内眦外移，W<1.95,无鼻根宽大，四肢无畸形活动正常，双侧耳廓外形正常，外耳道通畅，鼓膜完整，标志清晰。双耳：OAE未通过，声导抗“A”型，ABR、ASSR示极重度感音神经性聋。头颅MRI、颞骨CT及腹部B超无异常。散瞳验光，屈光度在正常范围，视力检查不合作。新一代测序：先证者MITF基因(NM_000248)7号外显子出现1个杂合突变，核苷酸变异为c.649_651delAGA、氨基酸变异为p.R217del。根据ACMG指南，该变异初步判定为致病性变异，HGMD数据库已有该位点WS的致病性报道[8];为ESP、1000G或EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异；经家系验证分析，受检人父母该位点无变异，此变异为自发突变。

先证者2男，6岁。发现左侧虹膜呈亮蓝色6年就诊于我院眼科，否认耳聋家族病史和耳聋药物服用病史。查体：面部色素沉着，左侧虹膜呈亮蓝色(图1b),无内眦外移，W<1.95,无鼻根宽大，四肢无畸形活动正常，毛发颜色大致正常，双侧耳廓外形正常，外耳道通畅，鼓膜完整，标志清晰。查视力1.0;双耳：OAE未通过，声导抗“A”型，纯音听阈示轻度感音神经性聋；腹部B超未见明显异常。新一代测序：先证者MITF基因(NM_001354605)10号外显子有1个杂合突变：c.1177-1G>A,为剪接突变。根据ACMG指南，该变异初步判定为致病性变异，可能导致基因功能丧失；为ESP、1000G或EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异；经家系验证分析，受检人父母该位点无变异，此变异为自发突变。

先证者3女，1岁。出生时听力筛查未通过，1个月后复筛未通过，就诊于我院，否认耳聋家族病史和耳聋药物服用病史。查体：右侧虹膜呈亮蓝色(图1c),内眦外移W>1.95,鼻根宽大，肢体活动正常，毛发颜色大致正常，双侧耳廓外形正常，外耳道通畅，鼓膜完整，标志清晰。双耳：OAE未通过，声导抗“A”型，ABR、ASSR示极重度感音神经性聋；头颅MRI、颞骨CT及腹部B超无异常。散瞳验光，屈光度在正常范围，视力检查不合作。新一代测序：先证者PAX3基因(NM_181457)5号外显子有1个杂合突变：c.587_593delCCTCAGC,导致氨基酸改变p.A196Dfs*18,为移码突变。根据ACMG指南，该变异初步判定为致病性变异，可能导致基因功能丧失；为ESP、1000G或EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异；经家系验证分析，受检人父母该位点无变异，此变异为自发突变。

上述3例先证者无视力、智力障碍，其父母语言发育正常，非近亲结婚。查体：虹膜颜色正常，无内眦异位，肢体活动正常，毛发颜色正常。纯音测听提示无听力下降。

3例先证者的听力情况见图2;3个WS家系遗传图谱见图3;WS先证者及家属的Sanger测序图见图4。

4、讨论

WS主要诊断标准包括：①先天性感音神经性聋；②虹膜色素异色；③毛发低色素改变；④内眦异位；⑤直系亲属(父母、同胞、子女)患病，同时符合2个主诊断标准可确诊WS[9]。本研究3例患儿均有先天性感音神经性聋和虹膜异色的临床表现，符合2个WS主诊断。先证者1和先证者2均确诊为WS2型，2例患儿通过新一代测序技术均检查出MITF突变。临床上15%～20%的WS2都是由MITF基因的杂合突变引起的[10]。MITF(小眼畸形相关转录因子)基因在人类染色体定位于3p12.3-p14.1,编码的MITF蛋白由419个氨基酸组成，是一种含有bHLH-Zip结构的转录因子。MITF基因通过调控信号通路和转录因子完成对听觉系统的调节，参与并调控多种神经嵴源性细胞的生长发育过程，尤其对黑色素细胞的生存、迁徙、增殖和分化有重要作用，MITF基因的突变会影响黑色素细胞的发育和功能，可以降低耳蜗内淋巴液K+浓度，从而影响毛细胞的功能引起耳聋[11]。

先证者1MITF基因(NM_000248)7号外显子出现1个杂合突变，核苷酸变异为c.649_651delAGA、氨基酸变异为p.R217del,MITF基因第217号氨基酸在不同物种中高度保守，该氨基酸缺失可能会导致编码的蛋白缩短，该突变位点位于7号外显子对应于MITF蛋白的bHLH-Zip结构域，该变异会破坏bHLH-Zip结构域的完整性。该结构域由44个氨基酸组成，具有高度的保守性及DNA结合能力，其结构域的完整性和准确性对MITF蛋白发挥功能至关重要，bHLH-Zip结构域的完整性受到破坏，从而影响MITF蛋白的功能。先证者2MITF基因10号外显子c.1177-1G>A变异发生在经典剪接受体位置，该变异可能导致供体-受体无法正常识别，造成10号外显子的异常剪接，从而产生异常蛋白。先证者3内眦外移，上肢无畸形，可确诊为WS1型，该患儿通过新一代测序技术检查出PAX3突变。临床上约80%的WS1患者可检出PAX3的突变[12]。该先证者PAX3基因5号外显子c.587_593缺失7个核苷酸CCTCAGC,导致第196号氨基酸发生移码突变并提前终止，最终产生截断蛋白。该变异可能导致同源结构域的缺失，而不能与DNA有效结合，从而影响PAX3转录因子的功能。PAX3转录因子具有高度保守性[13],其功能异常会影响色素细胞的发育，使耳蜗血管纹暗细胞无法发育，导致耳蜗内环境的离子浓度平衡被破坏，最终导致听力下降[14]。研究者发现临床上多数WS患者家长表示虹膜异色但视力未发现异常，对生活无影响，而听力下降是其最关心的问题。听力下降可能是由于黑素细胞异常使耳蜗血管纹功能异常最终导致感音神经性聋，对于重度及极重度患儿可采取人工耳蜗植入进行干预[15]。本组先证者1于2年前在我科行双侧人工耳蜗植入术(澳大利亚CI512),术中双耳24个电极阻抗及22个蜗内电极神经反应遥测NRT均正常，康复训练2年后言语识别率测试结果单音节识别率得分91.0%,双音节识别率94.0%;安静状态下句子识别率97.0%,目前可以正常进行语言交流，很好地融入了普通幼儿园学习。先证者2轻度耳聋，平时交流无明显障碍，在长期随访观察中；先证者3于2年前在我科行右耳人工耳蜗植入术(奥地利SONATATi100F28),术中12对电极阻抗及神经反应遥测NRT均正常，开机2年言语识别率测试结果单音节识别率得分85%,双音节识别率87%,患儿能够很好地融入平常的生活，2021年1月再次行左耳人工耳蜗植入术(奥地利SONATATi100F28),术中12对电极阻抗及神经反应遥测NRT均正常。

通过新一代测序技术可明确3例WS先证者的分子病因，WS为常染色体显性遗传，根据孟德尔遗传规律，上述先证者子代有50%可能患病，生育后代聋儿的风险极高，建议其成年后组建家庭时行遗传咨询和产前诊断。本研究中2例极重度感音神经性聋患儿均行人工耳蜗植入术，术后经康复训练，均获得良好的可理解的言语能力。由于患儿数量少，目前关于WS相关基因突变行人工耳蜗植入术的疗效特别是远期疗效还有待进一步研究。

文章来源：徐彬,戴继任,毕静,付勇.新一代测序技术在3例Waardenburg综合征患儿中的应用[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2021,35(10):910-913+919