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基于网络药理学探讨六味地黄丸防治卵巢早衰作用机制

2025-03-03 94 上传者：管理员

摘要：目的基于网络药理学方法探究六味地黄丸防治卵巢早衰的作用机制。方法通过获取六味地黄丸的活性成分及其作用靶点并筛选与卵巢早衰相关的靶点。构建“药物-活性成分-作用靶点”网络得到核心靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络筛选关键节点效应团；进行通路富集分析。结果经筛选得到药物与疾病共同作用的靶点有162个，PPI网络分析得到核心靶点为TP53、MAPK1、FOS、JUN、NR3C1、MYC、CCND1、MAPK8。KEGG通路富集分析发现AGE-RAGE信号通路、Th17细胞分化、IL-17信号通路、癌症信号通路、TNF信号通路、HF-1信号通路等与卵巢早衰相关。结论六味地黄丸抗卵巢早衰可能通过作用于TP53、FOS、JUN等靶点，AGE-RAGE和Th17细胞分化等信号通路增强卵巢功能，延缓卵巢早衰。

关键词：
不孕症
六味地黄丸
卵巢功能衰退
卵巢早衰
网络药理学
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卵巢早衰是指发生于未满40岁的育龄期女性中的卵巢功能衰退[1]｡该疾病受遗传､免疫､代谢和药物等多因素影响,早期以月经推迟､经量减少为症状,常伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低,最终可表现为闭经和不孕症[2]｡近年来,随着生活压力的增加及环境污染的加重[3],卵巢早衰发病有年轻化趋势且发病率逐年增长[4],其继发疾病亦严重影响女性身心健康,防治女性卵巢早衰具有重要意义[5]｡现代医学中以激素替代治疗(HRT)作为卵巢早衰治疗手段[6],但该疗法停药后易复发,不能有效恢复卵巢功能,且罹患乳腺癌､子宫癌､脑卒中的风险升高[7]｡近年来,安全性更高､不良反应更小的中医药治疗在卵巢早衰防治中备受关注[8-12]｡中医学认为,卵巢早衰的基本病机乃肾衰[13],患者因雌激素降低,会出现潮热多汗､面部潮红､性欲低等阴虚症状｡六味地黄丸甘淡性平,补而不滞,乃滋阴补肾之代表方,临床上亦用于治疗卵巢早衰[14-16]｡现代研究证明,六味地黄丸具有调节机体免疫系统[17]､调节神经内分泌作用[18],但尚缺乏其防治卵巢早衰作用机制的相关研究｡故本研究基于网络药理学方法,分析六味地黄丸防治卵巢早衰的作用机制,以期为未来的临床应用提供参考｡

1、资料与方法

1.1筛选六味地黄丸潜在活性成分及其作用靶点通过TCMSP数据库检索并筛选六味地黄丸组成的全部化学成分,以生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18为标准进行筛选,构建潜在活性成分数据库｡利用SwissTargetPrediction数据库和TCMSP数据库,导入构建的潜在活性成分数据库,将物种限定为“Human”,筛选得到相关作用靶点;应用Uniprot数据库,对靶点进行名称标准化,构建六味地黄丸作用靶点数据库｡

1.2筛选卵巢早衰相关作用靶点利用GeneCards､DrugBank､OMIM数据库获取卵巢早衰的作用靶点,合并去除,使用Uniport数据库对作用靶点进行名称标准化,得到卵巢早衰作用靶点数据库｡

1.3获取六味地黄丸与卵巢早衰的交叉靶点将六味地黄丸潜在活性成分靶点数据库与卵巢早衰相关作用靶点数据库进行匹配,获取六味地黄丸和卵巢早衰的交叉靶点,构建韦恩图｡

1.4构建成分⁃靶点网络使用Cytoscape3.6软件,构建六味地黄丸“成分⁃靶点”网络｡其中,“节点”用来表示潜在活性成分或靶点,“边”用来代表潜在活性成分和靶点之间的联系,使用NetworkAnalyzer插件进行参数分析｡

1.5构建蛋白质⁃蛋白质相互作用(PPI)网络将得到的共有靶点信息输入String数据库,获得PPI关系信息,使用Cytoscape3.6软件进一步建立可视化PPI网络,采用CytosNCA插件根据网络节点的拓扑属性筛选关键节点效应团｡

1.6GO富集分析和KEGG通路富集分析采用R语言“clusterprofiler”包对得到的效应靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,将阈值设定为P<0.05,筛选得到相关的生物过程和信号通路｡

2、结果

2.1六味地黄丸活性成分及其交叉靶点筛选得到六味地黄丸活性成分42个,其中牡丹皮2个,茯苓8个,山药14个,山萸肉13个,熟地黄､山萸肉､山药均含有活性成分1个,泽泻､山萸肉､牡丹皮､熟地黄均含有活性成分1个｡通过对六味地黄丸潜在活性成分进行靶点预测,得到相关靶点数目:牡丹皮158个,茯苓18个,山药64个,山萸肉55个,熟地黄27个,泽泻5个,合并､整理重复靶点,最终得到191个作用靶点｡经数据库检索筛选､去重后得到4107个卵巢早衰作用靶点,六味地黄丸潜在作用靶点191个,交叉对比得到162个交叉靶点｡

2.2成分⁃靶点网络的构建将42个活性成分及其对应的191个潜在核心靶点输入Cytoscape3.6软件,构建六味地黄丸活性成分⁃靶点网络｡见图1｡

图1六味地黄丸成分⁃靶点网络图

2.3六味地黄丸防治卵巢早衰潜在作用靶点的PPI网络将162个六味地黄丸防治卵巢早衰的潜在作用靶点输入STRING数据库,得到162个效应靶点,552条边｡采用CytosNCA插件根据网络节点的拓扑属性筛选关键节点,得到PPI网络核心靶点效应团,发现TP53､MAPK1､FOS､JUN､NR3C1､MYC等关键靶点｡见图2､图3｡

图2六味地黄丸防治卵巢早衰潜在作用靶点的PPI网络

图3六味地黄丸PPI网络核心靶点效应团

2.4GO和KEGG通路富集分析GO富集分析以P<0.05为条件,GO分析包括生物过程(BP)､细胞组分(CC)和分子功能(MF)3个方面,分别取前10条目录绘制气泡图｡BP主要涉及营养水平､脂多糖反应､类固醇激素､氧化应激反应､化学应激反应等;CC主要涉及膜筏､膜微域､转录调节复合物等;MF主要涉及DNA结合､转录因子结合､泛素⁃蛋白连接酶结合､核受体活性､类固醇激素受体等｡见图4｡

KEGG通路富集分析筛选出差异性最好的前30位信号通路,包括:癌症信号通路､AGE⁃RAGE信号通路､白细胞介素(IL)⁃17信号通路､肿瘤坏死因子(TNF)信号通路､HF⁃1信号通路､Th17细胞分化等｡见图5｡

图4六味地黄丸防治卵巢早衰GO富集分析

图5KEGG通路富集分析气泡图

3、讨论

卵巢早衰据其临床表现可归于中医学“月水先闭､经水早断､不孕症”等范畴,中医认为“肾气⁃天癸⁃冲任⁃胞宫”生殖轴与卵巢早衰的关系密切｡肾藏精,乃先天之本,五脏六腑之根,肾气盛则阴阳冲和,月事以时下;而肾精不足､阴阳失调则“天癸竭,地道不通,故形坏而无子”[19]｡由此,肾虚精亏是卵巢早衰的病因病机之一[20]｡六味地黄丸具有滋肾填精之功,本研究通过网络药理学分析六味地黄丸防治卵巢早衰的活性成分､潜在作用靶点和作用通路探讨其分子作用机制｡

通过构建PPI网络发现六味地黄丸防治卵巢早衰的潜在靶点主要为TP53､MAPK1､FOS､JUN､NR3C1､MYC､CCND1､MAPK8等｡TP53是一种转录因子激活靶基因,介导DNA修复､代谢､细胞周期阻滞､凋亡､衰老和自噬[21],是目前人类癌症基因分析中最常见的癌症抑制基因｡MAPK作为具有多种细胞功能的激酶,参与细胞生长､分化､增殖和凋亡[22]｡MAPK1通过磷酸化活化TP53基因,一方面致使DNA损伤诱导细胞周期阻滞,细胞走向凋亡[23];另一方面若发生DNA修复异常将影响卵泡的生长发育,从而诱发卵巢早衰[24]｡卵巢早衰被认为是细胞增殖､分化和转化的调节剂,其过表达也与细胞凋亡有关[25]｡卵巢早衰可与JUN形成同源或异源二聚体,改变自身与DNA结合的特异性,形成转录因子复合物AP⁃1并与DNA结合,从而调节靶基因的表达[26]｡以上研究充分说明了潜在靶点在六味地黄丸防治卵巢早衰中可能发挥的作用机制｡

GO富集分析结果显示,六味地黄丸防治卵巢早衰涉及营养水平､脂多糖､类固醇激素､氧化应激､化学应激､DNA结合､转录因子结合､泛素⁃蛋白连接酶结合､核受体活性､类固醇激素受体等｡氧化应激参与包括MAPK､NF⁃κB､TP53在内的各种细胞信号通路和转录因子的激活,调节细胞生长､自噬和凋亡[27]｡类固醇激素可介导细胞主动性､程序性死亡,脂多糖可抑制细胞类固醇激素的产生[28],干预下丘脑⁃垂体⁃卵巢轴的内分泌功能[29]｡进一步说明,六味地黄丸防治卵巢早衰与氧化应激､细胞凋亡等生物过程息息相关｡KEGG通路分析结果提示,六味地黄丸通过调控AGE⁃RAGE信号通路､IL⁃17信号通路､Th17细胞分化､癌症信号通路､TNF信号通路､HF⁃1信号通路等防治卵巢早衰｡AGE与RAGE相互作用会促进活性氧的产生,激活NF⁃κB,进而激活TNF⁃α､IL⁃1､IL⁃2等促炎细胞因子的表达和释放,使细胞增殖加速卵巢的衰老[30]｡Th17通过持续分泌IL⁃17介导炎性因子释放,参与炎性反应致使卵巢组织免疫性损伤导致卵巢早衰[31]｡研究发现,卵巢早衰患者经治疗后Th17水平降低[32]｡提示六味地黄丸可能通过调节炎性因子的水平,纠正机体免疫功能紊乱达到防治卵巢早衰的效果｡

综上所述,本研究利用网络药理学方法挖掘其中机制,从理论上证明六味地黄丸可通过多成分､多靶点､多途径防治卵巢早衰｡为今后挖掘此方防治卵巢早衰的临床运用和科学研究提供依据､方向和思路,助力中医药的创新与发展｡

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