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基于卵巢毒性的雷公藤多苷配伍减毒研究

2020-10-17 206 上传者：管理员

摘要：目的：通过分离、鉴定并培养大鼠卵巢颗粒细胞,筛选出能够抑制雷公藤多苷对大鼠卵巢颗粒细胞损伤的药物。方法：收集21～23d龄的SD大鼠卵巢颗粒细胞,经FSRH免疫荧光鉴定。设置空白组、模型组、5种药材(过路黄、藤茶、淫羊藿、黄芪、当归)与雷公藤多苷的样品组,采用CCK8法检测比较各组卵巢颗粒细胞的存活率;ELISA法测定各组卵巢颗粒细胞所释放雌二醇及孕酮的量。结果雷公藤多苷干预大鼠卵巢颗粒细胞后,细胞存活率明显降低,雌二醇和孕酮的释放量明显减少。分别加入过路黄、藤茶、淫羊藿、当归、黄芪配伍,结果：显示雷公藤多苷与黄芪配伍后其卵巢颗粒细胞细胞毒性显著减小,雌二醇和孕酮的释放明显增加。结论：黄芪能够逆转雷公藤多苷对SD大鼠卵巢颗粒细胞的细胞毒性,增加雌二醇和孕酮的释放。

关键词：
卵巢颗粒细胞
妇科
雌二醇
雷公藤多苷
黄芪
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雷公藤多苷是从卫矛科植物雷公藤根中提取精制而成的一种脂溶性混合物,是我国较早研究利用的抗炎免疫调节中草药成分,有“中草药激素”之称。雷公藤多苷具有抗炎[1,2]、抗肿瘤[3,4]、免疫调节[5,6]、抗生育[7,8]等多种活性,临床上被广泛用于治疗炎性疾病、自身免疫性疾病、器官移植甚至肿瘤。但雷公藤多苷卵巢毒副作用明显,长期服用易造成女性患者闭经、月经减少、卵巢早衰等,严重限制了其在临床的应用[8,9,10]。目前临床主要采取配伍激素序贯性替代治疗雷公藤多苷所致生殖功能减退,但激素替代疗法会带来风险,包括肺栓塞、脑卒中、深静脉血栓和胆囊疾病等不良反应[11,12]。由于雷公藤多苷在临床上对自身免疫性疾病的独特疗效,几乎没有可以完全替代的类似药,因此如何在充分发挥雷公藤多苷疗效的同时减毒,最大限度地降低其毒副作用是临床目前亟待解决的问题。

卵巢颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞,在卵泡发育中起着重要的作用,其数量及分泌雌激素和孕激素的功能与卵泡发育状况成正相关,卵泡体积愈大,颗粒细胞数量愈多,产生的激素值愈高[13]。因此,卵巢颗粒细胞的细胞毒性是评价药物对雌性动物卵巢毒性的重要的体外指标。

中药配伍作为中医遣方用药的特色优势,配伍减毒是中医遣方用药的基本形式,通过配伍来降低或消除有毒中药的毒副作用,已成为临床药物研发的热点方向之一。前期通过文献调研,笔者发现过路黄、藤茶、淫羊藿、黄芪、当归等药物均能配伍减轻雷公藤的毒副作用[14,15,16],但这些药物与雷公藤多苷配伍对卵巢毒性的研究还未见报道,故本文以大鼠卵巢颗粒细胞体外筛选药物对雷公藤多苷卵巢毒性的减毒作用。

1、材料

1.1试药

过路黄采于湖南中医药大学药植园,藤茶、淫羊藿、黄芪、当归购于湖南福泰中药饮片有限责任公司,经湖南中医药大学中药教研室周日宝教授鉴定为过路黄(LysimachiachristinaeHance)的全草、藤茶[Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang]的干燥叶、淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)的干燥叶、黄芪(AstragaluspropinquusSchischkin)的干燥根、当归[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的根,雷公藤多苷片(江苏美通有限公司,批号:160902,规格:10mg/片)。孕马血清促性腺激素(PMSG)、TritionX-100(Solarbio科技有限公司);DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(NCM)、无支原体胎牛血清(Gbico);卵泡刺激素受体(FSHR)兔多克隆受体(immunoway)、FITC标记羊抗兔IgG抗体(联科生物有限公司);4%多聚甲醛、DAPI染料、孕酮(P)、雌二醇(E2)免疫检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2实验动物

10只雌性SD大鼠,SPF级,日龄19～21d[湖南斯莱克景达实验动物有限公司,使用许可证编号:No.SYXK(湘)2013-0003]。

1.3仪器

光学倒置显微镜(MoticAE2000),荧光显微镜(OLYMPUS-U-HGLGPS),高速冷冻离心机(YINGTAI-TGL16),CO2细胞培养箱(上海上苗WJ-1608-II型),全自动酶标仪(北京普朗DNM-9602型)等。

2、方法

2.1样品制备

取雷公藤多苷片打粉机粉碎,称取粉末200.0mg,加入70%乙醇回流提取2次(料液比1∶20),提取液浓缩,得88.3mg浸膏,4℃保存,备用。过路黄、藤茶、淫羊藿、黄芪、当归药材分别用打粉机粉碎,各取药材粉末10.0g,用50%乙醇回流提取2次(料液比1∶20),提取液浓缩后,蒸干至浸膏,其浸膏重量分别为过路黄(1.3g)、藤茶(1.9g)、淫羊藿(1.5g)、黄芪(3.6g)、当归(5.4g),4℃保存,备用。

2.2大鼠原代卵巢颗粒细胞的分离与培养

取21～23d龄健康雌性SD大鼠,皮下注射PMSG20IU,进行阴道涂片检查,发现大鼠处于发情期时颈椎脱臼处死,75%乙醇浸泡消毒,置于超净工作台中解剖,去除卵巢周围组织及脂肪,迅速放入4℃预冷的无菌DMEM/F12培养基中吹打清洗,用头皮针刺破卵泡并推压,使卵巢颗粒细胞释放入DMEM/F12培养基中,离心管内吹打成细胞悬液,胰蛋白酶消化40min后加入完全培养基终止消化,200目筛网过滤,重复2次,1000r·min-1离心8min,弃上清液,向沉淀中加入完全培养基制成细胞悬液,台盼蓝染色,计数板计数,以终浓度为1×105个·mL-1的细胞悬液接种于T25细胞培养瓶中,24h后换液,PBS清洗去除未贴壁细胞。

2.3大鼠卵巢颗粒细胞FSHR表达鉴定

取细胞爬片于24孔板中,平行3份,每孔加入完全培养基1mL,加入细胞1×104个/孔。细胞爬片后,吸出培养基,PBS清洗后加入4%多聚甲醛于4℃固定30min。将爬片清洗吸干水分,用含10%血清的0.25%TritionX-100封闭液封闭2h,破膜封闭后,取一抗FSHR兔多克隆受体4℃孵育过夜,室温避光二抗孵育2h后,PBS清洗3次,每次5min,染DAPI5min,PBS清洗3次,每次5min。OLYMPUS荧光倒置显微镜下,卤素灯光源激发绿色荧光,进行观察、拍照。

2.4CCK8法检测雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞细胞毒性

取处于生长对数期的细胞消化并吹打成单个细胞,加入培养基调整细胞浓度至2.0×105个·mL-1。将细胞接种至96孔板中,细胞贴壁后每孔加入终浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μg·mL-1的雷公藤多苷培养液(DMSO浓度为0.5%),设置空白对照(0.5%的完全培养基),培养24h(或以上,n=6)。吸弃培养基,加入1×PBS洗涤2次,每孔加入100μL新鲜培养基和10μLCCK8试剂,摇匀,37℃孵育1h,于450nm处检测吸光度。以空白孔吸光度的均值计为存活率100%。

2.5雷公藤多苷细胞毒性的减毒药物筛选

取对数生长期的细胞消化并吹打成单个细胞,加入培养基调整细胞浓度至2.0×105个·mL-1。将细胞液加入至96孔板中,每孔细胞液200μL。24h后加入不同干预因素[空白组:完全培养基200μL;模型组:雷公藤多苷(100μg·mL-1)的完全培养基200μL;样品组:雷公藤多苷(100μg·mL-1)+各药材浸膏(400μg·mL-1)]的完全培养基200μL,各孔DMSO浓度均为0.5%。

2.6雷公藤多苷与黄芪配伍对卵巢颗粒细胞释放孕酮和雌二醇的影响

按照“2.5”项下方法进行细胞铺板和加样干预[空白组:完全培养基200μL;模型组:雷公藤多苷(2.5μg·mL-1)的完全培养基200μL;样品组:雷公藤多苷(2.5μg·mL-1)+不同浓度黄芪浸膏(25、20、15、10、5、2.5、1.25μg·mL-1)的完全培养基200μL,各孔DMSO浓度均为0.5%],干预24h后按照孕酮和雌二醇浓度检测的试剂盒说明书操作,分别检测细胞培养液中孕酮和雌二醇的含量。

2.7统计学方法

应用SPSS12.0统计软件对数据进行统计处理,数据用x¯±s表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析,两组间比较采用LSD-t检验,以P<0.05代表差异有统计学意义。

3、结果

3.1SD大鼠卵巢颗粒细胞形态学观察

初始阶段的卵巢颗粒细胞呈圆形或椭圆形;培养24h后细胞开始贴壁、繁殖;培养72h的SD大鼠卵巢颗粒细胞呈梭状(见图1)。

图1SD大鼠卵巢中分离的卵巢颗粒细胞(×100)

3.2大鼠卵巢颗粒细胞FSHR表达鉴定

由图2可知,经FSHR免疫荧光鉴定,细胞质内可见FSHR阳性染色定位,在卤素灯光源激发绿色荧光下可见FSHRV阳性细胞呈绿色荧光,FSHR蛋白平均阳性细表达数占总细胞数97%以上,满足后续实验要求。

图2SD大鼠卵巢颗粒细胞免疫细胞化学染色(×100)

3.3雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞细胞毒性的检测

图3结果显示,SD大鼠卵巢颗粒细胞经雷公藤多苷处理后,细胞活力受到明显抑制,并呈浓度依赖性,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),其细胞IC50为182.8μg·mL-1。

图3不同浓度的雷公藤多苷对SD大鼠卵巢颗粒细胞的影响

3.4雷公藤多苷细胞毒性的减毒药物筛选

加入不同药物配伍后各组细胞存活率分别为:过路黄组(27.04±1.75)%、藤茶组(16.32±0.71)%、淫羊藿组(23.91±3.36)%、黄芪组(89.54±4.49)%、当归组(27.87±2.30)%,与模型组(27.70±2.08)%比较,黄芪组减毒效果最佳(P<0.001),见图4。

图4雷公藤多苷配伍不同药物对SD大鼠卵巢颗粒细胞的影响

3.5雷公藤多苷配伍黄芪对卵巢颗粒细胞释放孕酮和雌二醇的影响

ELISA检测结果显示,经过雷公藤多苷处理后,SD大鼠卵巢颗粒细胞所释放的孕酮和雌二醇明显减少(P<0.05,P<0.01),结果见图5。然后根据雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞释放雌激素(雌二醇、孕酮)和雷公藤多苷细胞毒性(2.5μg·mL-1无细胞毒性)的实验结果,模型组以2.5μg·mL-1的雷公藤多苷进行干预,实验结果表明,加入10～25μg·mL-1黄芪干预的SD大鼠卵巢颗粒细胞所释放的孕酮和雌二醇较模型组明显增加(P<0.05,P<0.01),结果见图6。

4、讨论

卵巢颗粒细胞的正常增殖与分化直接影响着卵泡的生长、启动、发育、排卵、黄体形成以及激素分泌等卵巢基本功能,卵巢颗粒细胞引起的雌激素分泌减少是导致卵泡发育障碍的一个重要的病理基础[17],因此卵巢颗粒细胞是研究卵巢生殖及内分泌等功能的很好的切入点。

本实验研究发现,雷公藤多苷处理后的卵巢颗粒细胞活力及数量明显减少,药物IC50为182.8μg·mL-1。加入各组药物后,比较药物组和模型组对于大鼠卵巢颗粒细胞的存活率,发现黄芪对于雷公藤多苷的卵巢颗粒细胞毒性具有显著的抑制作用。且在低剂量的雷公藤多苷作用下,卵巢颗粒细胞所释放的孕酮和雌二醇明显降低,而黄芪干预后能明显改变上述情况,提示黄芪可能是通过增加卵巢颗粒细胞雌激素的释放来减轻雷公藤多苷导致的细胞损伤。

配伍是减轻有毒中药毒性的有效途径,雷公藤多苷配伍减毒增效,主要是通过选用能增强机体免疫、保护受损靶标这两方面的药物。黄芪具有保护肾脏、保护心血管、增强免疫及类性激素的功效,能够增强雷公藤多苷抗炎镇痛的药效。已有研究发现黄芪注射液能够激活雌激素受体,增加雌激素的释放,与本实验结果相符合,其作用可能与黄芪提取物中含有的某些成分有关[18],例如黄芪异黄酮、黄芪甲苷具有雌激素受体激活作用[19,20]。因此,黄芪对雷公藤多苷导致的卵巢颗粒细胞损伤的保护作用及机制值得进一步研究。

图5雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞释放雌二醇和孕酮的影响

图6黄芪配伍雷公藤多苷对卵巢颗粒细胞释放雌二醇和孕酮的影响

参考文献：

[2]李兰林,孙晓博,向大雄.天然药物中有效成分抗类风湿关节炎研究进展[J].中南药学,2011,9(2):130-134.

[3]郭忠聪,文静.雷公藤甲素增加乳腺癌细胞对阿霉素敏感性的实验研究[J].中南药学,2018,16(4):469-472.

[4]张慧,王瑞玲.米非司酮联合雷公藤多苷治疗子宫肌瘤的临床疗效观察[J].实用癌症杂志,2018,33(8):1361-1363.

[6]贺彬,彭向东.治疗支气管哮喘中药研究进展[J].中南药学,2005,3(5):315-318.

[7]樊媛芳,徐颖,苏晓慧,等.雷公藤多苷片对Ⅱ型胶原诱导性关节炎雄性大鼠生殖毒性的影响[J].中国中药杂志,2019,44(16):3486-3493.

[8]张婷婷,马晓莉.雷公藤多苷致卵巢早衰1例[J].解放军医学院学报,2017,38(12):1167-1168.

[9]路敏,周颖,崔一民,等.雷公藤多苷致闭经[J].药物不良反应杂志,2014,16(3):177-178.

[10]王新,王轶蓉.女性围绝经期综合征中医治疗[J].辽宁中医药大学学报,2016,18(11):107-109.

[11]郝丽,卢文,林辉,等.雌孕激素替代治疗雷公藤所致卵巢早衰的疗效观察[J].中华肾脏病杂志,2005,3(5):143-145.