宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)约占宫颈癌的80%～85%,发病与人乳头瘤病毒感染有关，好发于50～55岁女性人群，呈年轻化趋势[1,2]。我国每年死于宫颈癌的人群≥3万，且CSCC早期症状不明显，随着病情进展至晚期，肿瘤侵犯病灶周围组织或远处转移，严重威胁女性生命安全[3,4]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid, miRNA)是具有调节功能的内源性非编码小分子RNA,可参与宫颈癌组织细胞增殖、凋亡及侵袭、迁移等过程，是宫颈癌诊断、治疗靶标以及预后和疗效评估的新指标之一[5,6]。miR-372位于染色体19q13.42,参与人类多种恶性肿瘤恶性行为，在肿瘤发生、进展过程中表现出致癌或抑癌作用[7]。miR-372可通过调节细胞周期相关蛋白激酶活性，控制肿瘤细胞生长、细胞周期运行，促进胃癌和脑胶质瘤发生和进展[8]。miR-372在肾癌、乳腺癌组织及其细胞系中表达量降低，其表达量升高可促进肿瘤细胞凋亡，在不同类型肿瘤发生、进展过程中发挥关键作用[9],但miR-372在CSCC方面的相关研究报道较少。因此，本研究拟探讨miR-372对CSCC细胞SiHa细胞系恶性生物学行为的影响及其可能作用的靶标。

1、材料与方法

1.1一般资料

选取2019年1月至2022年6月重庆市开州区人民医院收治的63例行根治术治疗并经病理学确诊为CSCC患者作为研究对象。纳入标准：(1)术前未进行放、化疗；(2)自愿签署知情同意书；(3)年龄42～63岁。采集手术切除的癌变组织及其癌旁组织(距离癌组织5 cm)。本研究经医院伦理委员会通过批准。

1.2材料及仪器

1.2.1细胞材料

人源性SiHa细胞株(上海信裕生物科技有限公司)。

1.2.2试剂

miR-372 mimic、NC-miR、miR-372 inhibitors、NC-anti-miR(广州威佳科技有限公司),Lipofectamine ®2000(美国Invitrogen公司),pcDNA-E2F5质粒载体和其阴性对照(上海雅吉生物科技有限公司),MTT Kit(Sigma-Aldrich),兔多抗细胞增殖相关核蛋白(nuclear associated antigen, Ki67)与鼠多抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗体(武汉菲恩生物科技有限公司),双荧光素酶试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司),ECL Kit(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),RNAprep pure细胞试剂盒与Reverse Transcriptase Kit(天根生化科技北京有限公司),2×HSYBR qPCR Mix(北京庄盟国际生物基因科技有限公司),流式细胞凋亡检测试剂盒(上海嵘崴达实业有限公司),兔多抗细胞周期蛋白A1(Cyclin A1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)和兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)、兔多抗Caspase-3、兔多抗B淋巴细胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、兔多抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(武汉益普生物科技有限公司)。

1.2.3仪器

冷冻离心机(德国eppendorf公司),荧光定量PCR仪(德国Jena公司)。

1.3方法

1.3.1 miR-372靶基因预测

TargetScan/TargertScanS在线预测显示E2F5为miR-372的靶基因之一。

1.3.2细胞培养和转染

SiHa细胞株采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养(37℃、5% CO2),第3代细胞用于后续实验。细胞转染前24 h, SiHa细胞接种至6孔板(3×105/孔),采取无血清培养基培养过夜，待SiHa细胞汇合度>50%,按照Lipofectamine®2000试剂盒说明将分别转染至SiHa细胞，并分别记为miR-372组、NC-miR组、anti-miR-372组和anti-miR组，继续培养48 h,然后收集各组细胞用RT-PCR检测miR-372表达水平。明确各细胞系转染成功后，参照文献[10]将E2F5过表达质粒(pc-E2F5)、(5′-GAGGUACCCAUUCCAGAAATT-3′)及阴性对照(5′-UUAAAGUUGUAGUCAUCUGTT-3′)分别转染miR-372 SiHa细胞系，并分别记为miR-372+E2F5组、miR-372+pc组，RT-qPCR检测E2F5表达水平。

1.3.3 miR-372、E2F5表达检测

提取组织样本和细胞总RNA并逆转录生成cDNA用于RT-qPCR扩增模板，PCR扩增条件为：95℃3 min, 95℃12 s、40个循环，62℃1 min。miR-372,前引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAAGTGCTGCGACATTT-3′,后引物5′-GTGCAGG GTCCGAGGTT-3′,产物157 bp; E2F5,前引物5′-CACCTTCTGGTACACAACTGG-3′,后引物5′-GGGCTTAGATGAACTCGACTC-3′,产物128 bp; U6,前引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,后引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,产物109 bp;β-actin,前引物5′-AGCCATGTACGTACCCATCC-3′,后引物5′-ACCCTCATAGAT CCCGCACAG-3′,产物115bp; 2-△△Ct计算出miR-372、E2F5相对表达量。

1.3.4荧光素酶活性试验

软件预测在E2F5 3′-UTR与miR-372存在结合位点，并合成该位点及其突变体的DNA片段(E2F5 wt、E2F5 mut),克隆至双荧光素酶启动子载体pGL3,将miR-327 mimic共转染至SiHa细胞，孵育48 h,依据试剂盒操作说明比较各组细胞荧光素值变化。

1.3.5 MTT检测细胞活性

将转染成功SiHa细胞调整密度至3×104个/mL,以200μL/孔接种于96孔板，培养48 h后，加入MTT溶液反应4 h,于570 nm波长检测吸光值，细胞存活率=(转染组吸光值/阴性对照组吸光值)×100%。

1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡

将转染成功的SiHa细胞调整密度至4×104个/mL,以400μL/孔接种于6孔板，培养48 h后经离心弃上清，重悬细胞后加Annex-inV/FITC、PI混合，室温避光孵育15 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.7 Transwell检测细胞侵袭

将SiHa细胞以3×104个/孔接种至上室(预先用无血清Mateigel胶包裹),下室注入含血清培养基，培养24 h,棉签擦除未穿过膜的细胞，固定、1%结晶紫染色，记录高倍镜观察5个不重叠视野中细胞数取其均值。

1.3.8蛋白质印迹法检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE分离、转移至PVDF膜、室温密封2 h,洗膜后，加兔多抗Ki67、PCNA、Cyclin A1、CDK2、N-cadherin、E-cadherin、Caspase-3、Bcl-2、Bax抗体和兔抗人Caspase-9抗体(1∶500)4℃孵育过夜，将膜与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)偶联的抗小鼠/兔IgG 37℃孵育2 h,显色、曝光、定影。

1.4统计学分析

采用了SPSS 21.0及GraphPad Prism 5.0软件对数据进行统计分析。计量资料以(x¯±s)表示，组间比较符合正态分布的计量资料使用成组t检验，偏态分布的计量资料采用Mann-Whitney秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CSCC癌组织及其癌旁组织中miR-372和E2F5表达水平比较

宫颈鳞状细胞癌组织中miR-372表达水平低于其癌旁组织(P<0.05);E2F5表达水平高于其癌旁组织(P<0.05)。

图1癌组织及其癌旁组织中miR-372和E2F5表达水平比较  

2.2 miR-372过表达对SiHa细胞增殖的影响

miR-372 SiHa细胞活性和Ki67、PCNA、cyclin A1、CDK2蛋白水平均低于NC-miR组(P<0.05),anti-miR-372组细胞增殖率及Ki67、PCNA、cyclin A1、CDK2蛋白水平高于NC-anti-miR组(P<0.05)。见图2。

图2 miR-372过表达对SiHa细胞增殖的影响 

A.miR-372转染细胞RT-qPCR验证；B.各组细胞MTT检测结果；C.各组细胞Ki67、PCNA、cyclin A1、CDK2蛋白凝胶成像结果；D.各组细胞Ki67、PCNA、cyclin A1、CDK2蛋白相对表达水平统计结果。I.NC-miR组；II.miR-372组；III.NC-anti-miR组；IV.anti-miR-372组。*P<0.05，与NC-miR组比较；#P<0.05，与NC-anti-miR组比较。

2.3 miR-372过表达对SiHa细胞凋亡的影响

miR-372组细胞凋亡率和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平高于NC-miR组(P<0.05);anti-miR-372组细胞凋亡率和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平低于NC-anti-miR组(P<0.05)。见图3。

2.4 miR-372过表达对SiHa细胞侵袭的影响

miR-372组细胞侵袭数目和N-cadherin蛋白水平低于NC-miR组(P<0.05);E-cadherin蛋白水平高于NC-miR组(P<0.05)。anti-miR-372 SiHa细胞侵袭数目和N-cadherin蛋白水平高于NC-anti-miR组(P<0.05);E-cadherin蛋白水平低于NC-anti-miR组(P<0.05)。见图4。

2.5 miR-372与E2F5靶向关系确定

miR-372组细胞的E2F5相对表达水平低于NC-miR组(P<0.05),而anti-miR-372组细胞的E2F5相对表达水平高于NC-anti-miR组(P<0.05)。TargetScan/TargertScanS在线预测筛选结果显示E2F5 3′-UTR存在与miR-372结合位点，双色荧光素酶活性E2F5 wt/miR-327 mimic SiHa细胞的荧光素酶活性信号降低(P<0.05)。见图5。

在miR-372组细胞基础上过表达E2F5并检测细胞生物学行为，发现miR-372+E2F5 SiHa细胞增殖率、细胞侵袭数目和cyclin A1、CDK2、N-cadherin蛋白水平均高于miR-372+pc组(P<0.05);细胞凋亡率和Caspase-3、E-cadherin蛋白水平均低于miR-372+pc组(P<0.05)。见图6。

图3 miR-372过表达对SiHa细胞凋亡的影响  

A.各组流式术细胞检测结果；B.各组细胞凋亡率统计结果；C.Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白凝胶成像结果；D.Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达水平。I.NC-miR组；II.miR-372组；III.NC-anti-miR组；IV.anti-miR-372组。*P<0.05，与NC-miR组比较；#P<0.05，与NC-anti-miR组比较。

图4 miR-372过表达对SiHa细胞侵袭的影响  

A.各组细胞Transwell检测结果（400×）；B.各组细胞细胞侵袭数目统计结果；C.N-cadherin、E-cadherin蛋白凝胶成像结果；D.C图中蛋白相对水平统计结果。I.NC-miR组；II.miR 372组；III.NC-anti-miR组；IV.anti-miR-372组。*P<0.05，与NC-miR组比较；#P<0.05，与NC-anti-miR组比较。

图5 miR-372与E2F5靶向关系确定  

A.miR-372与E2F5靶向关系预测；B.双色荧光素酶活性信号检测统计结果。*P<0.05，与NC-miR组比较。

3、讨论

miRNA可通过与靶基因的mRNA的3′-UTR进行不完全互补配对结合，在转录水平调节其相关靶基因翻译水平，参与细胞生长、凋亡、侵袭等生理活动[11]。既往研究[12]发现已有195种miRNA在宫颈癌中高表达，呈低表达趋势则有96种。miR-372在卵巢癌组织中的表达水平明显低于正常卵巢组织和良性肿瘤组织，在抑制卵巢癌组织细胞生长过程中占据重要作用[13]。本研究显示，宫颈鳞状癌组织miR-372表达下调，而E2F5表达呈上升趋势，因此miR-372可能在宫颈鳞状癌生长过程中发挥调节作用。

宫颈鳞状癌细胞生长过程与细胞增殖密切相关，PCNA本质为DNA聚合酶δ辅助蛋白，对细胞增殖过程中的DNA复制有促进作用[14],还参与DNA复制所需的聚合酶合成，调节细胞分裂周期从G1期进入S期，其表达水平高低直接影响细胞的增殖速度[15]。Ki-67表达水平异常与恶性肿瘤细胞增殖、分化和转移关系密切[16]。Cyclin A1能与CDK2组成复合体促进细胞周期S期、G2/M期运转通畅，整合参与细胞生长过程中的多个信号通路。本研究通过构建转染细胞系发现miR-372过表达可降低细胞增殖和Ki67、PCNA、Cyclin A1、CDK2蛋白表达，miR-372低表达细胞呈相反趋势，说明miR-372过表达可以抑制SiHa细胞增殖，可能与影响细胞周期相关蛋白水平表达有关。

图6细胞增殖、凋亡和侵袭结果比较  

A．各组细胞MMT检测结果；B.流式细胞术检测结果；C.细胞凋亡率统计结果；D.各组细胞Transwell检测结果（400×）；E.各组细胞侵袭数目检测结果；F.cyclin A1、CDK2、N-cadherin、Caspase-3、E-cadherin蛋白表达。I.miR-372+pc组；II.miR-372+E2F5组。*P<0.05，与miR-372+pc组比较。

肿瘤细胞的恶性行为除细胞增殖失控外，还伴有恶性细胞侵袭病灶周围组织和细胞凋亡情况减弱。细胞凋亡信号刺激可促使Caspase家族成员活化状态与非活化状态发生改变，经Caspase-3蛋白诱导细胞凋亡。Bcl-2和Bax可以通过改变线粒体膜的通透性，调节细胞凋亡情况[17]。E-Cadherin、N-Cadherin是上皮-间质转化过程的标志物，上皮-间质转化可促进肿瘤细胞发生转移、浸润。本研究中，miR-372过表达可提高SiHa细胞系的细胞凋亡率和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax、E-cadherin蛋白水平，降低细胞侵袭数目和N-cadherin蛋白表达，miR-372低表达对SiHa细胞系的上述指标的作用趋势完全相反，表明miR-372过表达可抑制SiHa细胞侵袭和促进细胞凋亡。

E2F转录因子可通过调节DNA合成和增殖相关基因表达水平参与细胞周期运转，已有研究[18]表明miR-372-3p通过靶向作用E2F9调节肺鳞癌细胞的增殖和侵袭能力。本研究通过生物信息软件对miR-372预测分析发现miR-372可以与E2F5的3′-UTR的某些位点结合，证实E2F5是miR-372的靶基因，并且通过双色荧光素酶活性试验得到证实。本研究还显示，在miR-372过表达SiHa细胞系基础上提高E2F5表达量可以减弱miR-372过表达对SiHa细胞增殖和侵袭的抑制效果，降低SiHa细胞凋亡情况，并且还会影响miR-372过表达对SiHa细胞系中cyclin A1、CDK2、N-cadherin、Caspase-3、E-cadherin蛋白表达，说明miR-372可能通过靶向作用E2F5抑制SiHa细胞的恶性生物学行为。

综上，miR-372过表达可抑制SiHa细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡，可能与靶向作用抑制E2F5表达有关，但关于其中具体作用机制还需要进一步研究。

参考文献:

[3]张仲华,刘晨瑛,任会叶,等.2003—2018年间中国女性宫颈癌发病与死亡趋势研究[].中华疾病控制杂志,2022,26(1):14-20.

[4]张红,胡晓霞,洛若愚,等.卵泡抑素样蛋白1与宫颈癌高危型HPV感染关联性研究[U].中华肿瘤防治杂志,2019,26(10),675-681.

[5]林元,邓森灵,符春丽,等.血清miR-92a及miR-224表达水平预测宫颈癌患者预后价值[J.中华肿瘤防治杂志,2020,27(20):1651-1656.

[6]张英,马瑞霞,董学彩,等.miR-191在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2020,27(10):1126-1130.

基金资助:重庆市开州科技指导计划项目(20191503);

文章来源:王冬苗,税明才,熊林等.miR-372靶向E2F转录因子5抑制宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞的恶性生物学行为[J].川北医学院学报,2023,38(07):877-882.