宫颈癌是全球女性第4位常见恶性肿瘤，严重威胁女性健康[1]。2020年全球有60.4万新发宫颈癌和34.2万死亡病例[2]。目前，手术、放疗和化疗是宫颈癌的主要治疗手段[3]。初始治疗后，30%～50%的宫颈癌患者会出现肿瘤复发或转移，其长期生存率仅为10%～20%[4]。因此，复发性或转移性宫颈癌是妇科恶性肿瘤治疗的难点，也是提高患者生存率的关键点。随着肿瘤靶向治疗、免疫治疗的研究，寻找宫颈癌新的生物学标志物及治疗手段已成为临床研究热点。

纤维介素(fibroleukin/fibrinogen-like protein 2,fgl2),又称fgl2凝血酶原酶，属于纤维蛋白原超家族的成员。研究发现，人纤维介素(human fibroleukin/fibrinogen-like protein-2,Hfgl2)可表达于人体各脏器中，参与细胞黏附、细胞迁移、凝血及免疫调节等[5]。既往研究显示，fgl2凝血酶原酶参与病毒诱导的炎症反应、自身免疫性疾病、流产和肿瘤等相关疾病的发生发展[6,7,8]。目前，关于Hfgl2对宫颈癌发病的影响及作用机制尚不清楚，且相关研究甚少。本研究通过检测宫颈癌组织中Hfgl2的表达，分析其与宫颈癌临床病理特征之间的关系，并探究Hfgl2对宫颈癌恶性生物学行为的影响，以期寻找潜在的生物标志物和分子治疗靶点，为宫颈癌的治疗提供新的策略。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月至2018年1月在榆林市第一医院经病理确诊的50例宫颈癌患者的癌组织标本作为实验组，另外收集同期50例正常宫颈组织作为对照组。实验组患者纳入标准：①具有完整的病例资料；②经宫颈活检或手术切除后病理诊断为宫颈癌；③术前均未接受放化疗治疗；④术前六个月内未服用激素类药物。排除标准：①严重血液系统疾病；②严重免疫系统疾病；③严重心肝肾功能不全；④全身感染性疾病；⑤预计生存时间不足3个月。对照组患者纳入标准：①因子宫肌瘤行子宫切除术；②病例资料完整。对照组排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并其他脏器严重功能障碍；③合并免疫功能疾病或血液系统疾病。

所有患者年龄在37～68岁之间，其中50岁以下52名，50岁及以上48名。所有宫颈癌患者按照国际妇产科联盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics, FIGO)2018年宫颈癌标准分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期29例，Ⅲ-Ⅳ期9例；病理分级：G1级22例，G2-G3级28例；41例手术患者中淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者14例。本研究经榆林市第一医院医学伦理委员会批准(批号：2019-001),所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1免疫组化方法及评分标准

组织标本切成4μm薄片，切片放于玻片架上，63℃烘烤过夜。二甲苯脱蜡后乙醇水化，柠檬酸钠修复液高压热修复后3%的H2O2封闭10min,加入兔抗人Hfgl2抗体(1∶100),4℃过夜。二抗孵育后DAB显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，1%氨水反蓝。乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，在显微镜下观察。免疫组化染色的片子，将染色结果显示为棕黄色、颗粒者视为阳性。采用Leica Qwin图像分析系统，对染色细胞所占比例进行评分(选取至少5个不同的400倍视野):其中0分为<5%,1分为5%～25%,2分为26%～50%,3分为51%～75%,4分为>75%。按照染色程度的强弱分为3级：其中弱染色计为1分，中度染色计为2分，强染色计为3分。每份切片最终评分=染色细胞计数比例分数×染色强度分数，结果分数<1视为阴性，≥1视为阳性。

1.2.2 mRNA表达检测

逆转录聚合酶链反应(reverse transcription po-lymerase chain reaction, RT-PCR)检测mRNA表达。TRIzol法提取细胞总RNA,进行反转录，反转录条件为37℃15min, 85℃5s,以反转录产物为模板进行RT-PCR,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参。引物序列：GAPDH-F:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;GAPDH-R:TGGTGAAGACGCCAGTGGA;Hfgl2-F:GCTCTGACTACTACGCAATA;Hfgl2-R:ATGTTCTGGTGAAGTTGGT。按照SYBR© Premix Ex TaqTM说明书进行，反应条件为Step1(1 Cycle) 95℃30s, Step2(40 Cycles) 95℃5s 60℃30s, Step3 Dissociation(1 Cycle)。实验重复3次。

1.2.3蛋白表达检测

从细胞中提取蛋白，二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid, BCA)定量测定浓度。蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳，应用Bio-Rad湿转法转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭1h,加入5%脱脂牛奶稀释的一抗[1∶1 000 Hfgl2、1∶500V血管内皮细胞生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)、1∶1 000蛋白激酶(protein kinase B,PKB/Akt)、1∶1 000磷脂酶C(phospholipase C,PLC)-γ、1∶500基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2、1∶500 MMP9、1:20 000 GAPDH]4℃孵育过夜，与相应的1∶20 000稀释的二抗室温孵育1h,加入增强型化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂，用Western Blot化学发光成像系统一体机进行曝光，采用ImageJ2×软件进行吸光度分析。

1.2.4细胞活性检测

四甲基偶氮唑盐比色法(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)检测细胞活性。将对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化后，接种于96孔板中(4×104个/孔),24h细胞贴壁后，实验组加入siRNA寡聚物，阴性对照组加入无血清培养基，作用6h后，更换成正常培养基。分别隔24h、48h、72h、96h后，每孔加入0.5mg/mL MTT,37℃孵育4～6h。加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)置于脱色摇床上充分振荡，用酶联免疫检测仪于490nm波长下测定各孔吸光度(optical delnsity, OD)值。

1.3统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。各阳性表达等计数资料使用频数(n)和百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验或Fisher检验。免疫组化评分等计量资料采用均数±标准差

表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。推断两个分类变量间有无相关性时使用Spearman相关系数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Hfgl2在宫颈癌组织中的表达

Hfgl2在宫颈癌组织中(见图1A)的阳性表达率高于正常宫颈组织(见图1B),差异有统计学意义(92.00% vs. 6.00%,χ2=73.990,P<0.05),见表1。Hfgl2在宫颈癌组织及正常宫颈组织免疫组化评分分别为(8.88±0.35)分、(1.00±0.50)分，Hfgl2在宫颈癌组织的免疫组化评分高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(t=8.022,P<0.05),见图1C。分别对宫颈鳞癌、腺癌进行分类统计，Hfgl2在宫颈鳞癌组织及正常宫颈组织免疫组化评分分别为(9.29±0.24)分、(1.00±0.50)分，Hfgl2在宫颈鳞癌组织的免疫组化评分高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(t=8.249,P<0.05),见图1D。Hfgl2在宫颈腺癌组织及正常宫颈组织免疫组化评分分别为(8.56±0.41)分、(1.00±0.50)分，Hfgl2在宫颈腺癌组织的免疫组化评分高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(t=7.399,P<0.05),见图1E。另外，RT-PCR测定表明，实验组Hfgl2 mRNA阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(84.00% vs. 6.00%,χ2=61.455,P<0.05),见表2。

图1 Hfgl2在宫颈癌组织中的表达  

表1 Hfgl2在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达[n(%)]

表2 Hfgl2 mRNA在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达[n(%)]

2.2 Hfgl2的表达与宫颈癌临床病理参素之间的关系

宫颈癌组织中，Hfgl2在宫颈癌FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期中的阳性表达率高于Ⅰ期、Ⅱ期组，差异有统计学意义(χ2=6.737,P<0.05);在病理分级中，Hfgl2在G2-G3级宫颈癌组的阳性表达率显著高于G1级组(χ2=7.147,P<0.05);在有淋巴转移的宫颈癌组织中，Hfgl2阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(χ2=12.037,P<0.05);年龄与Hfgl2的表达差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 Hfgl2的表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系[n(%)]

2.3 Hfgl2在三株人宫颈癌细胞的表达

采用Western blot方法检测Hfgl2在三株人宫颈癌细胞中的表达量，结果显示，三株人宫颈癌细胞中Hfgl2均有表达，在SiHa细胞中的表达量最高，见图2。进一步确证Hfgl2在宫颈癌中的作用，采用RNA干扰试剂干扰三株人宫颈癌细胞中的Hfgl2基因。采用RT-PCR实验进行验证，干扰后Hfgl2的mRNA表达量降低，表明所选择的寡聚siRNA片段可成功干扰Hfgl2基因，见图3。采用Western blot方法进一步验证RNA干扰三株人宫颈癌细胞中的Hfgl2基因，结果显示干扰后Hfgl2的蛋白表达明显降低，表明所选择的寡聚siRNA片段可成功干扰Hfgl2基因，见图4。

2.4敲降Hfgl2表达对宫颈癌细胞增殖的影响

采用上述实验中筛选得到的siRNA片段干扰三株宫颈癌细胞后，进一步考察了野生型的Hela、MS751和SiHa细胞在Hfgl2基因干扰后的细胞增殖能力，结果显示敲降Hfgl2,三株宫颈癌细胞的增殖能力明显降低，见图5。

图2 Hfgl2蛋白在三株人宫颈癌细胞中的表达 

图3 Hfgl2干扰结果RT-PCR验证  

图4 Hfgl2干扰结果Western blot验证 

图5敲降Hfgl2对宫颈癌细胞增殖的影响  

2.5敲降Hfgl2表达对宫颈癌细胞信号通路的影响

采用上述实验中筛选得到的siRNA片段干扰Hela细胞后，进一步考察了敲降Hfgl2基因对Hela细胞血管生成及增殖迁移相关信号通路的影响。在Hela细胞中敲降Hfgl2,与血管生成相关的VEGFR1表达下降，与细胞增殖相关的Akt和PLC-γ的蛋白表达也降低(t值分别为4.904、6.126、6.216,P<0.05),见图6。在Hela细胞中敲降Hfgl2,和细胞迁移密切相关的MMP2和MMP9蛋白表达均下调(t值分别为5.731、8.304,P<0.05),见图7。

图6敲降Hfgl2对Hela细胞VEGFR1、Akt和PLC-γ表达的影响  

图7敲降Hfgl2对Hela细胞MMP2和MMP9表达的影响  

3、讨论

3.1宫颈癌的概况及Hfgl2的生物学性质

宫颈癌的发生发展与高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)的持续感染高度相关。虽然宫颈癌筛查的推广及HPV疫苗的研发一定程度上提高了宫颈癌的防治效果，但晚期、复发性或转移性患者治疗效果及预后仍较差。近年来，免疫治疗和靶向治疗的发展为宫颈癌的治疗带来了机遇[4]。Fgl2凝血酶原酶在正常生理及感染性疾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等的发生发展中起着重要作用[6,9],可能有望成为肿瘤靶向治疗的新方向。

Hfgl2基因位于人类染色体7q11.23,是一种含有439个氨基酸的蛋白质，与纤维蛋白原的β和γ链有36%的同源性。生理情况下，fgl2以膜型和分泌型两种形式存在。膜型fgl2(membrane fibrinogen-like protein 2,mfgl2)具有丝氨酸蛋白酶活性，能直接将凝血酶原裂解成凝血酶，导致级联反应[5],同时还可以诱导纤维蛋白沉积，在微循环障碍和肿瘤血管新生方面发挥重要作用[5]。分泌型fgl2(soluble fibrinogen-like protein 2,sfgl2)主要由调节性T细胞分泌，能通过抑制树突状细胞成熟、促进B细胞凋亡、影响T细胞增殖分化及杀伤靶细胞，发挥负性免疫调节作用[10]。

3.2 Hfgl2在宫颈癌发生发展中的作用

近年来发现，fgl2在肝癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌和胶质瘤等多种实体瘤中高度表达，提示其可能与肿瘤的发生发展相关[11]。Ma等[12]报道，fgl2在胶质瘤组织中的表达明显高于正常组织，且参与了低级别胶质瘤向高级别胶质瘤的恶性转化。张岚[13]研究发现，fgl2在宫颈癌中表达升高，且与宫颈癌临床分级、病理类型及不良预后有关。本研究发现，Hfgl2在宫颈癌组织中高表达，并且FIGO分期晚、组织学分级差、淋巴结转移者中Hfgl2表达增高，提示Hfgl2可能与宫颈癌的恶性生物学行为有关，与上述相关文献报道一致。

3.3 Hfgl2影响宫颈癌恶性生物学行为的作用机制

目前普遍认为，fgl2主要是通过促进肿瘤的血管形成来发挥促瘤作用。Liu等[14]研究报道，fgl2参与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路，促进了结直肠癌肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Xiao等[8]研究显示，在暴发型肝炎小鼠模型中，fgl2通过调节核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、MAPK等信号通路促进巨噬细胞极化，加速疾病进展。此外，在脑胶质瘤的研究中发现[15,16],fgl2可以促进肿瘤微环境中巨噬细胞的极化和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)的增殖，从而增强免疫抑制功能来促进胶质瘤的进展。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是包括宫颈癌在内的多种癌性肿瘤的关键促血管生成因子，一直是靶向抗血管生成治疗的焦点。本研究中，敲降人宫颈癌细胞Hela中fgl2,VEGFR1表达明显下调。PLC与细胞增殖分化密切相关，PLC-γ属于其一种亚型[17]。Akt是生长因子诱导细胞存活的关键介质，Akt的活化参与肿瘤的侵袭迁移[18]。MMP在细胞外基质的降解和转化中起着特殊作用。有研究显示MMP2和MMP9的表达与宫颈癌扩散风险正相关，下调后可抑制癌细胞侵袭转移[19]。本研究显示，敲降人宫颈癌细胞Hela中fgl2,宫颈癌细胞体外增殖能力明显降低，与肿瘤细胞侵袭转移相关蛋白Akt、PLC-γ、MMP2和MMP9表达均明显下调，与上述相关报道一致。我们推测Hfgl2可能通过促进宫颈癌肿瘤血管生成、促进细胞增殖及迁移来影响宫颈癌恶性生物学行为的进展。

综上，Hfgl2在宫颈癌组织中高表达且与宫颈癌FIGO分期、病理分级及淋巴结转移有关。Hfgl2可能促进宫颈癌肿瘤血管生成及浸润生长，有望成为靶向治疗新方向。后期研究中，我们将增加样本量探索Hfgl2对宫颈癌的免疫调节作用及机制。

参考文献:

[1]周晖,刘昀昀,罗铭,等.《2023NCCN子宫颈癌临床实践指南(第1版)》解读[J].中国实用妇科与产科杂志,2023,39(2):189-196.

[4]谢鹏,晏俊芳.复发性子宫颈癌综合诊治中国专家共识(2022年版)[J].中华肿瘤防治杂志,2022,29(24):1715-1724,1740.

[13]张岚.宫颈癌患者Fgl2凝血酶原酶､D-二聚体表达及与临床预后关系[J].中国计划生育学杂志,2020,28(6):868-871,876.

[17]孟凡华,葛彦明,王素霞,等.系统性红斑狼疮的磷脂酶C-γ的致病机制及靶向治疗研究进展[J].实用医药杂志,2017,34(3):269-271.

基金资助:国家自然科学基金项目(82203465);

文章来源:江玉,裴美丽,陈茜,等.Hfgl2在宫颈癌患者组织中的表达及其临床意义[J].中国妇幼健康研究,2024,35(06):33-40.