血小板在受损血管内膜和破溃斑块表面的黏附和聚集，是冠状动脉粥样硬化易损斑块破裂和急性血栓形成的一个关键环节[1]。研究证实，血小板的活化程度与冠心病患者的远期预后及血栓发生率明显相关[2]。因此，抗血小板治疗不仅是治疗心血管疾病的基石，更是预防冠心病血栓事件发生的有效防御手段。氯吡格雷联合阿司匹林即双联抗血小板是冠心病患者特别是支架术后患者的首选治疗方案。然而，尽管接受规范的双联抗血小板治疗，部分患者仍会出现反复的缺血事件，抗血小板药物低反应导致的治疗后血小板高反应性是其中的一个重要原因。CREST研究指出氯吡格雷低反应发生率高达41%,阿司匹林低反应发生率仅为3%[3]。研究表明，氯吡格雷低反应导致的治疗后血小板高反应性是介入术后患者支架内早期血栓形成的独立预测因子[4]。

长期以来血小板反应性的检测是临床的难点，其方法多种多样，标准各不相同，采用不同实验方法各有利弊，且尚缺乏公认的氯吡格雷低反应的诊断标准。已有研究证实，microRNA(miRNA)的表达差异与血小板活性密切相关，因此可以作为血小板活化甚至心血管事件的预测因子[5,6]。那么miRNA是否与冠心病患者氯吡格雷低反应性有关，其是否可作为冠心病氯吡格雷低反应性的生物标志物，目前尚无相关的明确研究。课题组前期研究发现外周血单核细胞源性的miR-34a-5p、miR-370-3p、miR-432-5p和miR-495-3p与冠心病患者的血小板高反应性和血栓形成密切相关[7],因此本研究通过临床筛查探讨这4个miRNA与冠心病患者氯吡格雷低反应性的相关性，并进一步评价其诊断价值。

1、资料和方法

1.1 研究对象和分组

参照2013年欧洲心脏病学会(Europeansocietyofcardiology,ESC)发布的《稳定性冠状动脉粥样硬化性心脏病指南》[8],选取2016年10月—2019年5月中国中医科学院西苑医院心血管科收治的稳定型冠心病患者158例作为研究对象，其中男性122例，女性36例；平均年龄为(58.03±8.49)岁。纳入标准：①年龄18～70岁；②近7天内规律服用氯吡格雷(75mg/d);③知情同意，自愿签署知情同意书。排除标准：①近1个月内参加过其他临床试验、有感染、发热、创伤、烧伤、手术史者；②近6个月内合并急性期脑卒中者；③合并有精神、免疫、肝肾、造血系统功能异常或恶性肿瘤者；④处于妊娠、哺乳期及月经期的妇女。入组后应用光比浊法检测二磷酸腺苷(adenosinediphosphate,ADP)诱导的血小板聚集率，参照权威文献[9],ADP诱导的最大血小板聚集率(maximumplateletaggregationrate,MPAR)≥65%的患者进入氯吡格雷低反应组(低反应组),MPAR<65%的患者进入氯吡格雷正常反应组(正常反应组)。本研究获得中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批(2016XLA129-2)。

1.2 临床资料采集

研究人员采集受试者的一般临床资料，包括年龄、性别、身高、体质量、心血管危险因素(包括吸烟史、饮酒史、相关慢性病史)、心肌梗死病史、血运重建病史、心绞痛CCS分级和近期用药情况。

1.3 血小板聚集率检测

采用光比浊法检测ADP诱导的血小板聚集率：使用含3.8%柠檬酸钠的真空采血管采集受试者静脉血2mL,室温下将抗凝血样以40g/min离心10min,吸取300μL上清即富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)装入有金属转子的比色杯；剩余血样以120g/min继续离心10min,吸取300μL上清即贫血小板血浆(platelet-poorplasma,PPP)放入另一只空比色杯中；根据血小板聚集仪(北京普利生公司，型号LBY-NJ4)说明书操作，以贫血小板血浆作为对照，在富血小板血浆中加入3μLADP(终浓度为20μmol/L)后300s内读取MPAR。

1.4 外周血单核细胞RNA提取

使用EDTA抗凝管采集受试者静脉血2mL,利用密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheralbloodmonouclearcells,PBMC)。血液按1∶1比例加入磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution,PBS)稀释后，加至3mL淋巴细胞分离液的上层，避免混合，20℃、400g离心20min,吸取单核细胞层后与PBS按1∶3体积混合，再以20℃、500g离心10min,得到PBMC沉淀，加入1mLTrizol试剂混匀，-80℃冰箱保存。选用mirVana试剂盒(美国Ambion公司)提取PBMC中的总RNA,依据试剂盒说明书进行操作。

1.5 实时荧光定量PCR检测

应用实时荧光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction,qRT-PCR)技术检测4个miRNA(miR-34a-5p、miR-370-3p、miR-432-5p、miR-495-3p)在两组患者PBMC中的表达差异。选择U6作为内参，合成miRNA引物，引物序列为：miR-34a-5p正向5′-ATGGTTCGTGCGTGGCAGTGTCTTAGCTGG-3′,反向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACCAG-3′;miR-370-3p正向5′-ATGGTTCGTGCGGCCTGCTGGGGTGGAACC-3′,反向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGGTT-3′;miR-432-5p正向5′-ATGGTTCGTGCGTCTTGGAGTAGGTCATTGG-3′,反向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACCCAA-3′;miR-495-3p正向5′-ATGGTTCGTGCGAAACAAACATGGTGCACT-3′,反向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAGAAGTG-3′;内参U6正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。应用miRNA反转录试剂盒(美国ABI公司)制备cDNA。依据qRT-PCR试剂盒(美国ABI公司)说明书制备qRT-PCR反应体系并放入PCR仪(美国ABI公司，型号7500)进行扩增，将反应条件依次设定为：94℃预变性10min;94℃15s、60℃60s、72℃10min进行45个循环。miRNA的表达定量以Ct值表示，确保将3次重复检测的Ct值误差控制在±0.2以内。利用DataAssist软件，采用2-ΔΔCt法计算miRNA在氯吡格雷低反应患者中的相对表达量，相对表达量≥2的miRNA为差异miRNA。

1.6 统计学处理

使用SPSS20.0软件统计数据，GraphPadPrism6软件作图。计量资料以x¯±s表示，正态分布数据采用独立样本t检验，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料以百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验，等级资料采用Kruskal-Wallis秩和检验。相关性分析采用Pearson相关性检验。所有假设检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。应用MedCalc15.2.2软件进行受试者工作特征(receiver-operatingcharacteristic,ROC)曲线分析，分析差异miRNA的ROC曲线下面积(areaunderthecurve,AUC)、特异度、灵敏度和最大约登指数，依据约登指数计算最佳截断值。

2、结果

2.1 临床基线资料比较

研究筛选158例稳定型冠心病患者，最终入组35例氯吡格雷低反应患者，按年龄、性别配对入组氯吡格雷正常反应患者35例。两组患者在体质指数(bodymassindex,BMI)水平、吸烟饮酒习惯、相关病史、相关药物服用情况和心绞痛轻重程度等方面的资料均无统计学差异(P>0.05),组间可比性较好(表1)。低反应组患者的MPAR显著高于正常反应组患者(P<0.01)。

2.2 冠心病氯吡格雷低反应相关的差异miRNA

miR-34a-5p、miR-370-3p、miR-432-5p和miR-495-3p在两组患者PBMC中的表达水平见图1。与正常反应组相比，miR-34a-5p和miR-495-3p在低反应组患者中的相对表达量显著升高，且差异倍数大于2(P<0.05),而miR-370-3p和miR-432-5p在低反应组患者中的表达差异不显著(P>0.05;图1)。

2.3 miR-34a-5p和miR-495-3p与冠心病患者血小板聚集率的相关性

应用Pearson相关性检验分析miR-34a-5p和miR-495-3p与冠心病患者MPAR的相关性，结果表明miR-34a-5p和miR-495-3p的相对表达量与冠心病患者的MPAR均呈显著正相关(r=0.709,P<0.01;r=0.597,P<0.01;图2)。

2.4 miR-34a-5p和miR-495-3p对冠心病氯吡格雷低反应的诊断价值

将有差异表达的miR-34a-5p和miR-495-3p纳入ROC曲线分析，结果显示，miR-34a-5p单一诊断冠心病氯吡格雷低反应性的ROC曲线下面积(AUC)为0.789(95%CI:0.674～0.877),灵敏度为74.29%,特异度为74.29%;miR-495-3p单一诊断的AUC为0.787(95%CI:0.673～0.876),灵敏度为80.00%,特异度为62.86%;miR-34a-5p和miR-495-3p联合诊断的AUC为0.873(95%CI:0.772～0.941),灵敏度为100.00%,特异度为65.71%(图3和表2)。miR-34a-5p和miR-495-3p联合诊断的AUC显著高于miR-34a-5p(P<0.05)或miR-495-3p(P<0.05)单一诊断，表明两者联合的诊断价值优于单一miRNA。依据约登指数计算得出，miR-34a-5p的诊断阈值为相对表达量>1.32;miR-495-3p的诊断阈值为相对表达量>1.36;miR-34a-5p与miR-495-3p联合诊断的诊断阈值分别为相对表达量>1.69和相对表达量>0.85(同时满足)。

3、讨论

血小板在受损血管内膜处的黏附和聚集，是动脉粥样硬化易损斑块破裂和急性血栓形成的一个关键环节。氯吡格雷低反应导致的治疗后血小板高反应性是冠心病血栓事件发生的独立危险因素。当前临床中，光比浊法检测的血小板聚集率是诊断治疗后血小板高反应性的金标准[10]10]。然而，光比浊法检测需血液量大、操作繁琐、耗时、可重复性差、仪器之间可比性难以估量，并且检测结果易受血液浊度影响而出现系统误差，限制了其临床应用[11]11]。其他一些替代方法包括血栓弹力图、流式细胞术等同样存在操作繁琐、费用昂贵等问题，并且其对稳定型冠心病患者早期血栓形成的预测效应仍存在争议，也没能在临床中大规模应用。因此，对于鉴别冠心病患者氯吡格雷治疗后的血小板高反应性，寻找灵敏度和特异度更高的、更简便的新型生物标志物势在必得，对预防血栓形成、减少心血管事件发生有重大意义。

miRNA是一类内源性的短链非编码RNA,每个miRNA约由22个核苷酸构成，通过与靶标mRNA分子上的互补序列相结合以调控蛋白质的合成[12]。miRNA有着多靶点、微调控的作用特点，其对于心血管疾病的调控作用在过去十年中逐渐引起人们的重视[13,14]。以往文献指出，miRNA在冠心病患者体内存在表达差异，有希望成为冠心病的新型、无创性生物标志物和治疗靶点[15]。PBMC作为一种有核细胞，理论上涵盖了人体内所有的miRNA种类，是循环miRNA的重要来源。课题组前期利用基因芯片高通量测序和大样本的qRT-PCR验证，证实PBMC源性的miR-34a-5p、miR-370-3p、miR-432-5p、miR-495-3p与冠心病患者的血小板高反应性和微循环障碍相关，其中miR-34a-5p可作为血栓高风险状态的重要标志物[7]。

以往研究表明，miR-34a-5p可促进巨核细胞分化生成血小板[16]并影响肝脏凝血因子的表达[17],同时miR-34a-5p高表达与内皮功能障碍[18,19]和血管炎症[20]均相关，对心血管事件具有一定预测价值[21]。有报道指出，miR-495-3p在活化的血小板中表达水平升高[22],并参与调控血小板活化，其机制可能与miR-495-3p通过靶向调控Kelchlike蛋白5基因表达有关[23]。而关于miR-370-3p和miR-432-5p对血小板功能的影响，目前尚没有相关报道。本次研究利用qRT-PCR检测发现，与冠心病氯吡格雷正常反应患者相比，miR-34a-5p和miR-495-3p在冠心病氯吡格雷低反应患者中存在显著的高表达，反映了两者在血小板活化聚集过程中的调控作用，与以往研究相呼应[7,17,22,23]。

本研究通过相关性分析发现miR-34a-5p和miR-495-3p在冠心病患者体内与MPAR呈显著正相关，且ROC曲线分析显示，miR-34a-5p和miR-495-3p单一诊断的AUC均>0.7,表明两者均可用于氯吡格雷低反应性的鉴别诊断；miR-34a-5p与miR-495-3p联合后进一步提高了对氯吡格雷低反应性的诊断价值，优于单独使用，特别是诊断灵敏度达到100.00%,可更灵敏地鉴别冠心病氯吡格雷低反应患者，但特异度偏低。同时，与传统检测方法相比，qRT-PCR检测所需的血液量更少、成本较低，miR-34a-5p和miR-495-3p联合检测仅需500μL外周血样本；且不易受样本纯度、浊度和环境光线的影响，使检测结果更稳定、可重复性好，更有利于临床应用推广。

当然，本研究不可避免地存在一些局限性。本研究为单中心试验，纳入分析的样本量较小，在纳入受试者时难免存在一定程度的选择偏倚。因此，未来需要通过多中心、大样本、设计更严谨的临床研究对结果做进一步的论证。同时，本研究揭示了miR-34a-5p和miR-495-3p联合应用作为冠心病氯吡格雷低反应性生物标志物的良好诊断价值，但其诊断特异度仍需提高，且两者诊断阈值的精确范围尚需要通过临床研究和实践进行论证和完善。

综上所述，miR-34a-5p和miR-495-3p的高表达与冠心病氯吡格雷低反应性显著相关，可作为冠心病氯吡格雷低反应性的新型生物标志物，两者联合应用可进一步提高诊断价值。

参考文献:

[11]于泽洋,何金婷,徐忠信.缺血性卒中患者血小板聚集率检测方法研究进展[J].中国实验诊断学,2016,20(1):152-154.

[14]瞿媛,顾宁.微小RNA在动脉粥样硬化易损斑块中的研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(6):548-552.

[19]肖丽,刘萍,秦冰.miR-34a通过调控Sirt1FoxO1通路影响血管内皮细胞凋亡[J].中国动脉硬化杂志,2021,29(3):193-200.

[21]李晓伟,奉淑君,周凤华,等.miR-34a在心血管疾病中的作用及机制研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2019,27(7):624-628.

文章来源：高洁,张莹,官宝怡,史大卓,马晓娟.基于microRNA的冠心病氯吡格雷低反应生物标志物研究[J].中国动脉硬化杂志,2022,30(02):135-140.