冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）简称冠心病，指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变，导致血管腔阻塞或狭窄，造成心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病。冠心病属中医学“胸痹”“心痛”范畴，其病位在心，病机关键为血脉瘀阻，血瘀证为冠心病中最常见的证型之一[1]。据世界卫生组织估计，到2030年，全球将有2 300万人死于心血管疾病[2]。我国心血管病现患病人数达2.9亿，其中冠心病患者1 100万[3]。而且在未来30年中，冠心病的发病率与死亡率还将继续上升。现阶段的人群由于不健康的生活方式、日益增加的社会压力等，使得冠心病患者的发病年龄更加年轻，若冠心病患者的首次发病年龄男性<55岁、女性<65岁，又称为早发冠心病（premature coronary heart disease,PCHD)[4,5]。研究表明，PCHD对比非早发冠心病而言，其遗传基础更突出，遗传因素占PCHD发病的一半以上[6]。且患PCHD的概率会随家族患病成员数量的增加而成倍增加[7]，家族遗传型的PCHD在临床上更加常见。

随着蛋白质组学技术的飞速发展，这项新技术也逐渐应用到各个领域当中，特别是医学研究中，其具备的高精度、高灵敏度及整体性特点不但可以快速发现与疾病相关的生物标志物，还可深层次研究疾病发病机制，对中医证候的探索也有巨大的参考价值[8]。为此本实验以家系PCHD血瘀证为研究对象，采用同位素相对标记与绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ）定量分析得到家系PCHD血瘀证的差异蛋白谱，并对差异蛋白进行GO功能与KEGG分析，对筛选出的差异蛋白采用Western blot验证前期iTRAQ技术结果，以期为临床早期诊断家系PCHD血瘀证提供潜在生物标志物。

1、资料与方法

1.1 一般资料

2019年8至12月在湖南省长沙市湖南中医药大学第一附属医院、金润中医院的流调工作中共收集到101例冠心病患者。其中包括男性57例，年龄（68.53±11.20）岁；女性44例，年龄（66.23±10.60）岁。实验组与对照组样本筛选流程如图1所示，8例样本信息编号如表1。本次研究经湖南中医药大学第二附属医院伦理委员会审查批准（2017.1—2020.12）。

图1 样本筛选流程图   

1.2 诊断标准

1.2.1 PCHD诊断标准

冠心病诊断标准参考2007年中华医学会心血管病学分会公布的“慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南”[9]和“不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南”[10]，诊断PCHD需首次发病年龄男性<55岁、女性<65岁[5]，且冠脉造影提示不少于1支冠状动脉直径狭窄≥50%。

表1 8例受试者样本信息对应表 

1.2.2 中医证候标准

冠心病血瘀证的辨证标准参照国家中医药管理局发布中华人民共和国中医药行业标准———《中医病症诊断疗效标准》[11]。心血瘀阻证辨证标准：主症（主要临床表现）为胸闷心痛，痛如针刺；次症（次要临床表现）为面色晦暗/口唇、青紫/爪甲发青；主要舌象为舌质紫暗/舌有瘀斑；主要脉象为细涩/结代；主症1项加次症2项加主要舌脉1项即为心血瘀阻证。其中，血瘀证评分准则依照中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的《冠心病血瘀证诊断标准》[12]，诊断冠心病血瘀证需总评分不低于19分，且血瘀证严重程度与评分呈正相关关系。

1.3 纳入标准

(1）符合“1.1”“1.2”中的诊断标准。（2）家系纳入标准：“PCHD血瘀证家系”标准为先证者的一级亲属中不少于1人为PCHD血瘀证患者；“PCHD非血瘀证家系”标准为先证者的一级亲属中不少于1人为PCHD非血瘀证患者。根据PCHD血瘀证先证者状况，纳入符合家系定义标准的一级亲属（包括父母、子女及亲兄弟姐妹）的所有人员，不限年龄与性别。并设置相应的健康对照组（即经病史调查、临床体格检查和相关生化检查证明无疾病的生理、心理健康者）。（3）知情自愿参与研究者。

1.4 排除标准

(1）早发冠心病首次发病男性年龄≥55岁或女性年龄≥65岁。（2）冠心病患者兼有以下各种疾病者：(1)甲状腺功能亢进性心肌病、糖尿病性心肌病、肺源性心肌病、高血压性心肌病、风湿性心肌病、贫血性心肌病；(2)恶性肿瘤、甲状腺疾病、严重肝肾疾病、结核等传染病、血液系统疾病、结缔组织疾病；(3)精神系统疾病。（3）受检者依从性差，不能完成全部临床检测，资料不全者。

1.5 样本采集

每位受试者空腹8 h后，留取肘静脉血10 m L。其中2 m L血样用普通采血管收集后于金润中医院检查血脂指标；2 m L血样用普通采血管收集后2 h内送湖南中医药大学第一附属医院医学检验与病理中心检查凝血常规；另外6 m L血样用EDTAK2抗凝采血管收集，室温静置2 min后于2 h内送湖南中医药大学科研楼中医诊断学实验室经4℃4 000 r/min半径10 cm离心12 min后取上清液，用离心管分装，放-80℃储存备用。血样运送时均放于有冰袋的保温箱中。

1.6 研究方法

1.6.1 质谱分析

对选取的家系PCHD血瘀证、非血瘀证患者及健康对照组血样进行蛋白质提取，采用测序级胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，冷冻并干燥肽段溶液后，以iTRAQ标记试剂盒标记酶切样品，用113～115标记为M1-1、M1-2、M1-3,116～118标记为M2-1、M2-2、M2-3,119～120标记为Control-1、Control-2，详见表2。经标记肽段除盐和标记肽段的高pH反相液相色谱分离后，选择液相色谱质谱/质谱联用（liquid chromatograph MS/MS,LC-MS/MS）进行蛋白质分析。

表2 肽段标记信息表  

1.6.2 数据库处理

使用Proteome Discoverer(PD）软件对质谱图进行筛选，将质谱数据输入（version2.2,thermo Fisher Scientific）后得到符合要求的质谱图。再采用PD内嵌的sequest进行搜索，搜库结果和上一步筛选的谱图通过PD软件进行定性分析；蛋白定量值通过提取iTRAQ报告离子的信号值进行重新计算，其中肽段定量值取中位数值表示，蛋白定量值为肽段定量值的累加和，选择差异倍数>1.2或<0.83且P<0.05表示蛋白表达量的显著升高或降低进行报告，最后对得到的蛋白数据进行GO功能注释和KEGG分析。

1.6.3 Western blot验证

采用Western blot对i TRAQ技术得出的差异蛋白结果进行验证，差异蛋白筛选标准：（1）检索蛋白功能提示该蛋白的生理功能受损可能导致疾病的发生发展；（2）该蛋白与冠心病相关研究的文献报道不多，深入挖掘该蛋白与冠心病的关系仍具有临床意义；（3）该蛋白在家系PCHD血瘀证与健康对照组之间的差异显著，但不属于家系PCHD非血瘀证与健康对照组之的差异蛋白；（4）质谱信号扫描检测中信号强，信噪比S/N高。

重新选取典型的家系PCHD血瘀证组及健康对照组受试者血样各6例进行Western blot实验研究。以BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白质浓度，经制胶、样品准备、电泳、转膜、封闭、一抗孵育[内参稀释比例：Transferrin(1∶20 000）]、二抗孵育、显色/曝光后，最后对实验结果进行分析。

1.7 统计学方法

使用SPSS 25.0软件对数据进行分析。计量资料用“”表示，经正态性、方差齐性检验：方差齐者，两组比较采用t检验，多组比较用方差分析；方差不齐者，使用秩和检验。计数资料采用构成比表示，采用χ2检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 差异蛋白筛选结果

iTRAQ技术定量分析后各组间共得到75个差异蛋白，详见图2。其中家系PCHD血瘀证组相比健康对照组共得到差异蛋白32个，包括22个上调蛋白与10个下调蛋白，两组间的差异蛋白表达热图详见图3；家系PCHD非血瘀证组与健康对照组的差异蛋白表达热图详见图4。

2.2 差异蛋白GO功能注释及Pathway功能分析

在家系PCHD血瘀证组与健康对照组的比较中，差异蛋白共涉及429个生物学过程，其与角质化、皮肤发展、蛋白质激活级联反应等关系最为密切；在代谢途径金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、血小板激活等KEGG通路上富集。详见图5—6。

2.3 Western blot验证结果

再次收集并筛选的6例家系PCHD血瘀证组与6例健康对照组的一般资料比较如表3所示，结果提示BMI与HDL-C的差异具有统计学意义（P<0.05），家系PCHD血瘀证组的BMI高于健康对照组，而HDL-C相反，说明HDL-C对人体有保护作用，而家系PCHD血瘀证患者一般体重偏胖；其他一般资料的结果对比差异均无统计学意义（P>0.05）。

根据上述差异蛋白筛选标准得到差异蛋白CFH(P-value=0.003），其蛋白表达较健康对照组低且P值显著。在Western blot实验结果中显示（见图7—8）：家系PCHD血瘀证组CFH的蛋白表达水平较健康对照组相比亦降低，差异有统计学意义（P<0.01），与前期iTRAQ结果相一致。

图2 差异蛋白表达Veen图  

3、讨论

现如今我国CHD患者人数众多，且CHD的发病年龄愈加呈现低龄化趋势（早发冠心病）。有研究表明，心血管疾病家族史是PCHD的独立危险因子之一[7]。在CHD的发生发展过程中，家族和遗传因素起着关键作用[13]。血瘀证作为CHD最常见的证型之一，但目前对CHD血瘀证的发病机制尚未明确，还需继续探究。而蛋白质组学技术是现阶段发展迅速的新兴技术，通过筛选出差异表达的蛋白质，得到具有特异性的潜在生物标志物，能为疾病的早期诊断提供有力的辅助证据。为此本研究采用iTRAQ技术定量检测家系PCHD血瘀证、非血瘀证患者及正常人间的差异蛋白情况，共得到75种蛋白质，其中家系PCHD血瘀证患者与正常人之间共发现了32种差异蛋白，包括22个上调蛋白与10个下调蛋白。经差异蛋白筛选后发现，CFH与本次研究的疾病关系最为密切，Western blot结果也验证了前期iTRAQ技术定量检测结果的可靠性与真实性，认为筛选出的CFH可作为家系PCHD血瘀证患者的潜在生物标志物。

图3 家系PCHD血瘀证组vs健康对照组组间差异蛋白热图   

图4 家系PCHD非血瘀证组vs健康对照组组间差异蛋白热图   

图5 家系PCHD血瘀证组差异蛋白GO富集图   

图6 家系PCHD血瘀证组vs健康对照组组间差异蛋白KEGG富集条目对应上下调蛋白数目  

表3 12例受试者的一般资料对比（n=6)  

图7 差异蛋白部分条带电泳图  CFH是存在于血浆中的一种补体调节蛋白，为补体激活抑制剂[14]。有报道显示，补体系统会在人类动脉粥样硬化病变中被激活，并受到补体成分和补体调节蛋白局部合成的积极调控[15]。在早期动脉粥样硬化病变处，特别是易损斑块和破裂斑块处发现多个补体途径来激活补体[16],CFH作为负调节因子在补体旁路途径发挥着重要作用，其通过与血清中C3b结合促进旁路途径中C3转化酶的灭活，达到抑制冠脉内膜表层补体激活，降低了血管炎症反应，抑制了动脉粥样硬化的形成[17]。孙彩琴等[18]在研究PCHD患者中血浆CFH浓度检测及临床意义时，发现较正常对照组而言PCHD组的CFH浓度明显降低，且与CHD的严重程度呈负相关关系，其认为是由于血浆中CFH的减少导致调节补体的能力下降，使旁路途径持续激活而致血管内皮损伤，促进了动脉粥样硬化及CHD的发展。由此可见，CFH可防止补体系统激活亢进而产生免疫病理反应，具有抗动脉粥样硬化的作用[19]。

图8 家系PCHD血瘀证组与健康对照组组间差异蛋白相对表达量比较   

CFH除了通过自身的负调节作用来抑制补体系统激活外，还可以通过与C反应蛋白（C-reative protein,CPR）相结合，下调促炎活性，在补体C3水平上调节补体数量，干扰LDL-C在粥样病变斑块处的新陈代谢，增强对动脉粥样硬化的抑制作用[20,21]。而且研究发现，CFH水平在冠状动脉病变的浅层比深层更大[17]，说明在冠脉病变早期，动脉血管内皮表层CFH的水平会增加，拮抗补体的过度激活来抑制炎症反应的发生，对抗动脉粥样硬化的发生，这也进一步说明了CFH与PCHD血瘀证关系密切。此外，有学者发现，CFH能与垂体同源盒家族因子3(paired like homeodomain 3,PITX3）产生正反馈调节，间接抑制纤维蛋白原和胶原蛋白的促血栓作用，在动脉血栓形成过程中发挥保护作用[22,23,24]。上述这些研究成果同样印证了本次实验结果，也更加说明CFH的低表达可能是造成家系PCHD血瘀证发生发展的因素之一。

当然，本次研究也存在需要改进的地方，虽然通过i TRAQ技术的广谱筛选和Western lot的二次验证能够证明差异蛋白的存在，但人的个体差异较大，加之iTRAQ实验中样本量不充足，可能会出现个别差异蛋白因为某个样本的个体差异导致出现误差，从而在广谱筛选中被剔除，故在未来的研究中，对于样本量的选择还应有更严谨的思考和计算，降低误差出现的概率。

总之，本次研究通过iTRAQ技术筛选到了家系PCHD血瘀证的差异蛋白谱，获得了与疾病发生发展关的生物学功系紧密能及相关通路，为进一步找到疾病的关键病因病机提供了有力参考，并初步筛选出差异蛋白CFH作为家系PCHD血瘀证早期诊断的潜在生物标志物，在蛋白层面为预防本病提供了参考依据，对未来进一步研究基于中药干预调控家系PCHD血瘀证的差异蛋白表达具有重要研究意义与临床价值。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81874375);湖南省自然科学基金项目(2022JJ30430);湖南省教育厅科学研究重点项目(21A0231);

文章来源:张书萌,李杰,于子璇等.CFH蛋白在家系早发冠心病血瘀证中的表达及意义[J].湖南中医药大学学报,2024,44(01):108-114.