摘要:目的 分析贵阳市利福平耐药情况与相关突变基因特征,为控制贵阳市耐利福平结核病提供基础和依据。方法 收集贵阳市公共卫生救治中心2022年6月至2023年6月疑似结核样本,采用微阵列基因芯片技术对结核分枝杆菌利福平rpoB基因进行检测,并将药敏试验验证结果于基因芯片法对比。结果 3 081例阳性标本中,痰标本(50.44%)及纤刷物标本(34.99%)占比最多,387例为利福平rpoB基因突变,突变率为12.84%(387/3013),6例结果显示其他突变类型,占全部突变类型的1.55%。结论 贵阳市地区rpoB基因突变率为12.84%(387/3013),531位点(C→T)突变率最高,其次是511(T→C)位点、526(C→T)位点,并且与其他地区存在差异。
结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterim tuberculosis,MTB)感染引起的慢性传染病[1]。2022年全球结核病报告显示,2021年全球耐药结核病患者达45万例,比2020年43.7万例增长了3.7%,就耐药结核病例数量而言,中国也仍是负担最重的7个国家之一[2]。
目前已经明确95%~99%的结核分枝杆菌耐利福平主要是因为rpo B基因在507-533位密码子共88bp的核心区域内(rifampicin resistance determining region,RRDR)碱基发生突变、缺失、颠换等导致的[3,4]。在rpo B基因突变中,531位点最为常见,但在已有研究中,各个国家报道的突变率不全相同:西班牙(72.3%)[5]、缅甸(63.6%)[6]和孟加拉(57.4%)[7]、新加坡(54.9%)[8]、巴西(56.1%)[9]等地的rpo B基因531位点突变率存在较大差异,可见rpo B基因的突变存在明显的地域性差异。
本研究采用微阵列基因芯片技术对结核分枝杆菌利福平rpoB基因进行检测,并将药敏试验验证结果于基因芯片法对比,验证基因芯片结果的一致性与可靠性,尝试分析贵阳市地区MTB利福平耐药和相关基因突变特征,为控制贵阳市耐利福平结核病提供基础和依据。
一、材料与方法
1样本来源
收集贵阳市公共卫生救治中心2022年6月至2023年6月来自门诊、住院的病人送检样本中经培养或抗酸染色阳性的疑似结核样本,送检样本类型包括痰(含咽拭子)9 884份、纤刷物8 539份、胸水1 650份、脑脊液1572份、粪便938份、尿液747份、肺泡灌洗液722份及其他类型样本共25 683份。
2 DNA提取和PCR荧光定量分析
将合格患者标本消化后,使用北京博奥晶典生物技术有限公司生产的分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)提取标本中的分枝杆菌DNA并进行PCR荧光定量分析,整个过程严格按照试剂盒说明书及标准操作规程(SOP)操作,以扩增曲线呈S型且CT值<36判断为阳性,使用试剂盒自带的阴阳性对照作为质控。所得DNA在-20 ℃冰箱冷冻保存备用。
3 结核分枝杆菌药物敏感性试验
将部分患者标本消化后培养,并进行改良罗氏比例法药物敏感性试验[10],药物选用利福平(RFP),药物在罗氏(L-J)培养基中的药物终浓度分别为40 μg/ml。37 ℃恒温培养箱培养4周后观察结果。质控菌株H37RV作为全敏感标准菌株。结果判定[11]:耐药:(含药培养基上生长菌落数/对照培养基上生长菌落数)×100%≥1%。
4 微阵列基因芯片检测
将所得MTB核酸阳性(CT<32)使用博奥生物集团有限公司生产的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法)进行检测,按照试剂盒说明进行扩增、杂交、洗涤干燥,最后扫描判读结果,以试剂盒自带的阴阳性对照作为质控,对照结核分枝杆菌利福平相关突变基因rpoB各突变位点微阵列图谱报告结果。
5 统计学方法
本研究使用SPSS22.0统计学软件对数据进行整理,计数资料采用使用(2检验,使用Kappa检验方法检验基因芯片检测结果和药物敏感性试验结果的一致性,P≤0.05时具有统计学意义,当Kappa>0.75时说明两者一致性良好,0.4≤Kappa<0.7表明两者一致性一般,Kappa<0.4表明两者一致性差。
二、结果
1 患者一般情况与MTB核酸阳性率
患者一般情况:患者来自贵州省贵阳市包括乌当、云岩、南明、花溪、白云、观山湖及三县一市的各个地区及贵州省其他地区,分布范围广泛。年龄范围包括1 d~99岁,其中男性患者共16 182人次,女性患者共9 633人次。
病人一般情况信息与MTB核酸结果见表1。年龄按照国际分段法分为婴幼儿(0~6岁)、儿童(7~12岁)、少年(13~17岁)、青年(18~45岁)、中年(46~69岁)、老年(70~)等组,各组间两两分析,婴幼儿、儿童;少年、青年;中年、老年三组间阳性率差异有统计学意义(均P<0.05)。男性与女性阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 MTB核酸检测结果与患者一般情况
MTB核酸PCR(荧光探针法)检测25 683例,其中3 081例阳性,阳性率12.00%(3081/25683)(表2)。表2结果进行统计分析,各类型间阳性率差异具有统计学意义(χ2=889.85,P<0.05),脓分泌物阳性率最高(29.86%),脑脊液阳性率最低(0.13%)。
表2 MTB核酸PCR(荧光探针法)检测结果
2 药敏试验与基因芯片检测结果一致性验证
MTB核酸阳性的3 081份样本中,随机选取了162份进行药敏试验,其结果与基因芯片法检测结果见表3。基因芯片检测结果与药敏试验结果间的Kappa值为0.831大于0.75,表明基因芯片检测结果与药敏试验结果一致性良好。
表3 基因芯片检测结果与药敏试验结果对比
3 RIF耐药与相关基因突变情况
3 081例阳性标本中,痰标本(50.44%)及纤刷物标本(34.99%)占比最多,各类型标本排除标本量过小的几类标本,总体rpoB突变检出率在5%~17.65%间,胸水和尿液突变检出率相对较低,脓分泌物与肺泡灌洗液突变检出率较高,见表4。
表4 3 081例阳性标本标本类型情况与各类型标本rpoB基因突变检出情况
将MTB核酸阳性的3 081例除去同一病人重复检测后共3 013例,全部进行微阵列基因芯片检测,结果见表5。其中387例为利福平rpoB基因突变,突变率为12.84%(387/3013),6例结果显示其他突变类型,占全部突变类型的1.55%。531位点(C→T)突变率最高,突变率为51.42%(199/387),其次是511(T→C)位点、526(C→T)位点,突变率为16.02%(62/387)、6.72%(26/387)。
表5 387例利福平rpoB基因突变类型分布情况
三、讨论
贵州地区是我国结核病的高发区,贵阳市公共卫生救治中心作为贵阳市感染病和结核病省级重点专科医院,患者数量庞大,标本数量多。本研究从该院的疑似结核标本中,通过核酸检测(PCR-荧光探针法)筛选出MTB阳性标本,以微阵列基因芯片法检测MTB利福平rpoB基因突变情况,3013例MTB阳性标本中387例出现利福平rpoB基因突变,突变率为12.84%。rpoB基因突变主要集中在507-533位的利福平耐药决定区(RRDR)[3,4],最常见的是531位点和526位点,531位点突变率大于526位点,其余位点包括508位点、511位点、513位点、516位点、522位点、526位点、530位点、531位点、533位点[12]。
本研究分析了患者年龄、性别对阳性率的影响,结果得到少年、青年组的阳性率更高,且差异有统计学意义;但性别方面男、女性阳性率差异无统计学意义。本研究使用的微阵列基因芯片法的检测位点包括511位点、513位点、516位点、526位点、531位点、533位点,检测结果中531位点(C→T)突变率最高,突变率为51.42%(199/387),其次是511(T→C)位点、526(C→T)位点,突变率为16.02%(62/387)、6.72%(26/387),为本地区最常见的3种类型,与欧维正等[13]的研究结果相符,但本研究所得利福平耐药突变率为12.84%对比本地区曾经报道的利福平耐药突变率下降了7.32%,526(C→G)位点、533(T→C)位点突变率分别升高1.02%和1.11%,出现了小幅上涨,511位点联合其他位点发生突变的情况也相对减少(9/552→1/387)。同时,本研究将基因芯片结果与“金标准”药敏试验结果进行一致性检验,再一次论证了微阵列基因芯片法在结核分枝杆菌耐药检测方面的可靠性。
各地报道的突变率、突变类型都有所差异,可能与造成耐药结核病发生的诸多影响因素有关,如人口流动、既往治疗史、经济水平等[14]。本研究所得结果与既往结果出现差异可能与研究时纳入样本、医生用药习惯及病人服药情况等因素有关[15]。
综上所述,本研究对贵阳市地区结核分枝杆菌利福平耐药情况和相关基因进行了分析,对比同地区的既往研究,发现了利福平耐药基因突变情况的变化趋势,为控制贵阳市耐利福平结核病的流行提供基础和依据。
参考文献:
[10]欧维正,骆科文,王燕,等.基因芯片和比例法药物敏感性实验检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究[J].检验医学,2013,5(28):404-407
[11]陈连勇,茹浩浩,杨星,等.云南省846株结核分枝杆菌药敏试验结果[J].昆明医科大学学报,2020,41(3):45-49.
[12]张凌峰,高梅.耐多药结核分枝杆菌利福平相关基因rpoB突变分析[J].当代医学,2013,19:15-16.
[13]欧维正,骆科文,陈峥宏,等.贵州地区结核分枝杆菌利福平耐药相关基因 rpoB突变特征分析[J].中国临床药理学杂志,2015,(10):833-835.
[14]汤科,孙宏虎,郑超,等.四川地区利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区突变分析[J].四川大学学报(自然科学版),2013,50(2):399-403.
[15]高敏,杨婷婷,李桂莲,等.基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌耐药突变特征分析[J].中华流行病学杂志,2020,41(5):770-775.
基金资助:贵阳市2022年度科技计划项目(筑科合同[2022]-4-9-1号);
文章来源:张蔓娜,陈秋悦,万亿等.贵阳市结核分枝杆菌利福平耐药与相关突变基因特征分析[J].中国病原生物学杂志,2023,18(12):1470-1473.
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2024-02-26结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病。根据世界卫生组织2023年全球结核病报告统计,2022年约有1 060万人罹患结核病,其中约有130万人因此而死亡[1]。结核病严重威胁着人类健康乃至生命,其致病菌MTB与固有免疫细胞的早期相互作用在很大程度上影响感染结局。因此,阐明MTB侵入机体后对固有免疫细胞的调控机制至关重要。MTB主要以气溶胶的形式通过呼吸道侵入机体肺部,激活抗结核感染中的第一道防线肺泡巨噬细胞,发挥吞噬作用[2]。
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