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小鼠心肌梗死进程中巨噬细胞CD59和P2X7表达的动态变化

2024-11-15 116 上传者：管理员

摘要：目的探讨小鼠心肌梗死进程中巨噬细胞亚群的动态变化与CD59、P2X7表达的动态变化。方法将成年雄性C57BL/6J小鼠36只随机分为对照组（不做任何处理，6只）和心肌梗死组（30只）。通过冠状动脉左前降支结扎建立小鼠急性心肌梗死模型，心肌梗死组30只小鼠又随机分为A、B、C、D、E组，分别在心肌梗死后1、3、5、7、14 d取材。收取小鼠的外周血和心脏组织，采用流式细胞术检测巨噬细胞亚群的动态变化与CD59和P2X7的表达情况。结果心肌梗死后1、3 d外周血中单核细胞数量均高于对照组[（9.5±1.7）、（10.3±3.7）×10～4/ml比（3.2±3.1）×10～4/ml]（均P<0.05）。心肌梗死后1、3、5 d心脏组织白细胞计数、巨噬细胞计数均高于对照组（均P<0.05）。心脏组织中Ly6Chigh巨噬细胞计数在心肌梗死后3 d达到高峰，而Ly6Clow亚群在心肌梗死后5 d达到高峰，均高于对照组（均P<0.05）。心肌梗死后1 d P2X7-CD59-巨噬细胞占Ly6Chigh巨噬细胞百分比高于对照组，而P2X7+CD59+巨噬细胞占比低于对照组（均P<0.05）。心肌梗死后1、3、5 d P2X7+CD59+巨噬细胞占Ly6Clow巨噬细胞百分比均低于对照组，而P2X7-CD59+巨噬细胞占比均高于对照组（均P<0.05）。结论在小鼠急性心肌梗死的不同阶段，心脏组织巨噬细胞的亚群呈现动态变化，同时伴随CD59和P2X7表达的动态变化。

关键词：
CD59
P2X7
巨噬细胞
心肌损伤
心肌梗死
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心肌梗死是由于部分心肌组织的血液循环突然中断而导致其供氧减少，最终造成了心肌细胞的坏死[1]。心肌细胞膜破裂之后胞质内容物释放到周围的组织中，引发炎症反应[2-3]。近年来的研究普遍认为巨噬细胞是心肌损伤部位的主要炎症细胞类型，参与心肌的损伤、修复和心室重构[4]。巨噬细胞在心肌损伤部位既可以通过释放基质金属蛋白酶降解胶原，又可以通过释放促纤维化的细胞因子促进胶原沉积，同时巨噬细胞既可以通过吞噬作用和促进血管新生有助于心肌损伤后的修复，又可以通过释放炎性介质加重心肌损伤[5]。这种“双刃剑”作用与巨噬细胞存在群体的异质性密切相关，巨噬细胞主要分为促炎的M1型和抗炎的M2型，近年来许多研究揭示了巨噬细胞不同亚型对各类疾病的不同影响[6-8]。有研究发现心肌梗死后巨噬细胞也存在不同亚群[9],但对于心肌梗死后巨噬细胞亚群的动态变化以及每种亚群的具体表达分子仍待进一步探索。本研究通过小鼠急性心肌梗死模型，对心脏组织中巨噬细胞的亚群及亚群的CD59和P2X7两种分子表达进行初步探索，以期进一步了解每种亚群的巨噬细胞功能。

1、材料与方法

1.1 试剂

红细胞裂解液购自美国BD公司，IA型胶原酶购自德国MERCK公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，FcR阻断剂CD16/32、CD59-FITC、F4/80-eFluor660购自美国ebioscience公司，P2X7-PE、CD45 Percp-cy5.5、CD11b-Alexa Fluor 700、Ly6C-V450购自美国BD公司，绝对计数流式管购自美国BD公司，本研究方案经首都医科大学附属北京安贞医院实验动物福利与伦理委员会批准(AZ2024LA015)。

1.2 实验动物及分组

成年雄性C57BL/6J小鼠36只(8周，体重20～22 g, 无特殊病原体级)购于北京华阜康生物科技有限公司，许可证编号：SYXK(京)2021-0042,普通饲料饲养，自由饮水。小鼠随机分为对照组(不做任何处理，6只)和心肌梗死组(30只)。心肌梗死组30只小鼠又随机分为A、B、C、D、E组，分别在心肌梗死后1、3、5、7、14 d取材，每个时间段6只。

1.3 心肌梗死模型制备

首先用异氟烷麻醉小鼠，仰卧固定好四肢，用酒精擦拭胸前皮毛。在心脏部位3、4肋间隙位置沿腋窝与胸骨下端连线做一个1.5 cm的切口。钝性分离胸大肌与肋骨外肌肉，于3、4肋间穿破肋间隙，挤出心脏，在左心耳下缘水平线下2 mm处用6-0丝线结扎冠状动脉，可见左心室前壁颜色由鲜红变为苍白，推回心脏，挤出胸内气体，4-0线缝皮关胸[10]。

1.4 标本采集

利用戊巴比妥对小鼠进行腹腔注射，根据小鼠体重按照50 mg/kg的剂量注射，小鼠的血样用肝素抗凝管收集。颈椎离断处死小鼠，取小鼠心脏组织，将心脏剪成碎片，用含1.6 mg/ml IA型胶原酶的磷酸盐缓冲液(PBS)在37 ℃条件下消化0.5 h。加入含20%胎牛血清的DMEM培养基充分混匀终止消化，吹打之后过70 μm的筛网，800×g离心10 min收集细胞，待行流式细胞术检测。

1.5 流式细胞术检测

取100 μl外周血，加入CD16/32抗体进行Fc受体阻断后，加入荧光标记抗体，混匀于常温避光孵育30 min, 加入1 ml红细胞裂解液，流式上机检测血液中单核细胞。取100 μl心脏组织细胞悬液，加入CD16/32抗体进行Fc受体阻断后，加入荧光标记抗体，混匀于常温避光孵育30 min。加入PBS吹打洗涤，800×g离心5 min之后再加入PBS吹打洗涤1次。PBS重悬细胞，流式上机检测心脏组织中巨噬细胞。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料以

表示，两两比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 外周血中单核细胞数量变化和单核细胞CD59和P2X7的表达情况

分析结果显示，心肌梗死后1、3 d外周血中单核细胞数量均高于对照组(均P<0.05)。外周血中单核细胞绝大多数为P2X7-CD59-细胞，少量为P2X7+CD59-细胞。心肌梗死后1 d, P2X7-CD59-细胞比例高于对照组，而P2X7+CD59-细胞比例低于对照组(均P<0.05)。见表1。

2.2 心脏组织巨噬细胞数量和巨噬细胞亚群的动态变化

小鼠心脏组织的巨噬细胞的圈门策略为CD45+F4/80+CD11b+,根据Ly6C的表达，将心脏组织的巨噬细胞进一步分为Ly6Chigh巨噬细胞和Ly6Clow巨噬细胞。心肌梗死后1、3、5 d心脏组织白细胞计数、巨噬细胞计数均高于对照组(均P<0.05)。心脏组织中Ly6Chigh巨噬细胞计数在心肌梗死后3 d达到高峰，而Ly6Clow亚群在心肌梗死后5 d达到高峰，均高于对照组(均P<0.05)。Ly6Chigh巨噬细胞占巨噬细胞百分比早期上升随后回落，而Ly6Clow巨噬细胞占巨噬细胞百分比早期下降随后回升。见表2、图1。

表1各组小鼠外周血单核细胞流式分析结果

2.3 心脏组织巨噬细胞亚群CD59和P2X7的表达情况

心脏组织Ly6Chigh巨噬细胞主要为P2X7-CD59-细胞和P2X7+CD59+细胞，心肌梗死后1 d P2X7-CD59-细胞占Ly6Chigh巨噬细胞百分比高于对照组，而P2X7+CD59+巨噬细胞占比低于对照组(均P<0.05)。Ly6Clow巨噬细胞主要为P2X7+CD59+细胞和P2X7-CD59+细胞，心肌梗死后1、3、5 d P2X7+CD59+细胞占Ly6Clow巨噬细胞百分比均低于对照组，而P2X7-CD59+细胞占比均高于对照组(均P<0.05)。见表2、图2。

3、讨论

巨噬细胞作为重要的炎症细胞不仅仅能清除碎片，还能调节组织再生[11-12]。巨噬细胞通常分为两大类：促炎(M1)型巨噬细胞和抗炎(M2)型巨噬细胞[13]。M1和M2型巨噬细胞的差异在于表面标记、产生的因子和细胞功能。M1型巨噬细胞分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-12等，这些因子促进炎症的发展；而M2型巨噬细胞产生大量的IL-10和转化生长因子β等细胞因子，有抑制炎症的作用[14-15]。

目前的研究认为心肌细胞死亡后，心脏迅速被M1型巨噬细胞浸润，成为心肌梗死后最初几天的主要细胞类型，在梗死后第3天达到峰值[16]。M1型巨噬细胞能够吞噬细胞碎片，降解胞外基质，并通过分泌促炎细胞因子来放大炎症反应；心肌梗死后的第4～7天，M2型巨噬细胞募集到梗死心肌部位，通过分泌抑炎细胞因子抑制炎症反应，并且促进胞外基质重塑和血管生成[17-18]。在心肌梗死后的最初几天，具有M1样促炎表型的巨噬细胞在梗死心肌中占优势，而在心肌梗死后期，具有M2抗炎特性的巨噬细胞变得更加普遍[19]。

本研究利用流式细胞术，以细胞膜表面分子Ly6C表达水平，将心肌梗死后心脏组织中巨噬细胞分为Ly6Chigh和Ly6Clow两个亚群。从巨噬细胞亚群的细胞计数上看，Ly6Chigh亚群的细胞计数在心肌梗死后3 d达到峰值，而Ly6Clow亚群的细胞计数在心肌梗死后5 d达到峰值。从2种亚群占巨噬细胞的百分比来看，2种亚群占比变化最显著的是心肌梗死后1、3 d。本研究数据表明Ly6Chigh和Ly6Clow两个巨噬细胞亚群拥有不同的动态变化规律。

CD59是补体抑制蛋白，当补体系统激活并已产生C5b-6、C7、C8复合物时，CD59会阻止补体成分C9聚集到上述复合体上，从而阻止膜攻击复合物的形成[20-22]。同时细胞也会收到信号，通过胞吞作用摄入CD59-CD9复合物[23]。这表明存在于细胞中的CD59对膜攻击复合物有抑制作用，使得细胞不会受到膜攻击复合物的攻击。本研究发现CD59在心肌梗死后外周血中的单核细胞低表达，而在心肌梗死后心脏组织中巨噬细胞不同亚型表达有很大差异，绝大多数Ly6Clow(M2)型巨噬细胞表达CD59。但是M2型巨噬细胞CD59的表达是否影响M2型巨噬细胞的功能，以及CD59是否可以作为M2型巨噬细胞的一个新标志物有待进一步研究。

表2各组小鼠心脏组织细胞流式分析结果

图1各组小鼠心脏组织巨噬细胞亚群的代表图

图2各组小鼠心脏组织巨噬细胞亚群CD59和P2X7表达代表图

嘌呤受体P2X7在多种炎症状态下表达上调，在多种心血管疾病中产生重要作用[24-26]。P2X7受体的活性依赖于细胞外ATP分子，在正常生理情况下，体内ATP浓度较低，不足以激活P2X7受体，当机体出现缺氧、损伤或者炎症刺激时，ATP被释放到细胞外，激活P2X7受体，引起细胞内K+外流、Ca2+和Na+内流，导致细胞膜去极化和通透性的变化[27-29]。最终调控了多种生理和病理活动，包括炎症的激活、炎症因子的释放、溶酶体的融合、自噬、细胞表面分子标志物的改变等[30]。P2X7在心肌梗死后外周血中的单核细胞低表达，而在心肌梗死后心脏组织中巨噬细胞不同亚型表达有一定差异，Ly6Clow(M2)型巨噬细胞中绝大多数细胞都表达P2X7,但是在Ly6Chigh(M1)型巨噬细胞中只有一部分细胞表达P2X7。P2X7在巨噬细胞亚群中的差异表达是否与巨噬细胞亚群的不同功能密切相关，还需要进一步研究论证。

综上所述，小鼠心肌梗死后外周血单核细胞中CD59和P2X7的表达比例都很低，而在心脏组织中大多数Ly6Clow(M2)型巨噬细胞表达CD59和P2X7。

参考文献:

[24]昂文成林龙珠,张展,淡一航,等.P2X7受体在心血管疾病中的研究进展[J].中国循证心血管医学杂志,2024,16(3):378-381.

[28]颜诗怡,陈诗垚,关飞,等.ATP-P2X7R轴在炎症性疾病中的作用[J].热带病与寄生虫学,2022,20(1):50-56,60.

[30]程实,梁晨,马英凯,等.P2X7受体在骨科疾病中作用的研究进展[J].骨科临床与研究杂志,2023,8(1):52-57.

基金资助:国家自然科学基金(32071338､82070371)~~;

文章来源:高明泽,孟佳丽,高慧,等.小鼠心肌梗死进程中巨噬细胞CD59和P2X7表达的动态变化[J].中国医药,2024,19(11):1626-1630.