急性心肌梗死（AMI）是我国成年人心血管疾病住院和死亡的第一位原因，且其发病率呈上升趋势[1]。再灌注治疗是救治AMI的关键手段，但30%接受治疗的AMI患者会经历心肌缺血再灌注损伤（MIRI），其可引发心肌损伤加重、恶性心律失常、心力衰竭等不良后果，甚至猝死[2]，因此，积极预防心肌缺血再灌注损伤意义重大。

目前临床上尚无明确治疗MIRI的药物，一般选用抗血小板聚集、改善能量代谢、钙离子抑制剂等，虽有一定治疗效果，但存在特异性弱、疗效低以及耐受性差等缺陷而使应用受到了一定限制，中药复方能活血化瘀，改善心肌供血有一定疗效。研究显示，血府逐瘀胶囊调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路减轻大鼠MIRI[3]；冠心丹参制剂通过miR-330-3p/乙醛脱氢酶2抗体（ALDH2）抑制大鼠心脏肥大细胞脱粒，从而改善大鼠MIRI[4]。因此，开发安全有效的抗MIRI中药具有较大的现实意义和应用前景。

金香丹由延胡索、青木香、郁金、降香、丹参组成，是湖北省荆州市中医院黄少祥主任医师在总结临床经验的基础上，由丹参饮化裁而来。金香丹组方用药与MIRI的“心脉痹阻”的病机相吻合，临床观察提示金香丹可以改善冠心病患者的临床症状、心电图异常；动物实验研究也表明，金香丹能降低心肌组织的氧化应激水平、凋亡程度，减轻MIRI模型大鼠的心肌损伤[5,6]。目前MIRI药物研究多从氧化应激、细胞凋亡、线粒体自噬等机制论述，而炎症反应是导致MIRI发生、发展的主要原因之一[7]。NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3）炎症小体通路在MIRI过程中发挥着重要作用。NLRP3被激活后能活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1），产生并释放大量白细胞介素-1β（IL-1β），造成炎性损伤。有研究表明MIRI通过激活NLRP3炎性体诱导Caspase-1介导的心肌细胞焦亡[8]；抑制ROSTXNIP/NLRP3通路改善大鼠MIRI[9]。但是，金香丹改善MIRI心肌细胞凋亡是否通过NLRP3通路，有待进一步明确。故本实验采用冠状动脉左前降支结扎及再灌注建立MIRI大鼠模型，观察金香丹对模型大鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路相关蛋白的影响，以期为MIRI药物研发、临床用药提供实验依据。

1、材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体质量（200±20)g，购自三峡大学动物实验中心，合格证号SCXK（鄂）2017-0012；饲养于湖北中医药大学实验动物中心，饲养温度（22±2）℃，相对湿度50%～70%，适应性喂养1周后开展实验。本实验由湖北中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.2药物与试剂

金香丹片由湖北省荆州市中医医院提供，由延胡索、青木香、郁金、降香、丹参中药组成，每片0.5g，批号20060520；乳酸脱氢酶（LDH），肌酸激酶（CK）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A020-1-2,A032-1-1);DNA断裂的原位末端标记（TUNEL）法细胞凋亡检测试剂盒，蛋白酶K（上海碧云天生物科技有限公司，批号分别为C1091,ST533）；苏木素-伊红（HE）试剂盒，兔多抗NLRP3抗体，小鼠多抗IL-1β抗体，兔多抗B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2）抗体，兔多抗Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体，BCA蛋白定量，兔多抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（武汉塞维尔公司，批号分别为G1001,GB13457,GB13463,GB113375,GB11690,G2026-1000T,GB11002）；兔多抗Caspase-1抗体（武汉三鹰公司，批号22915-1-AP);RIPA裂解液，ECL超敏发光液（北京索莱宝公司，批号分别为R0010,PE0010);SYBR实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR）试剂（上海东洋纺生物科技有限公司，批号QPK-201);TRIzol裂解酶（美国赛默飞世尔公司，批号15596026）。

1.3仪器

CR21G型4℃离心机（日本日立公司）；BX53型显微镜（日本Olympus公司）；LIOOS600T型荧光显微镜（日本尼康公司）；BL-420N型生物信号采集与分析系统（成都泰盟软件有限公司）；DHX-100型动物人工呼吸机（成都仪器厂）；AS型组织脱水机（赛默飞科技公司）；ZQP-86型切片机（上海之信仪器公司）；MultiskanFC型酶标仪（美国Thermo公司）；170-3940型转膜仪，Biospectrum凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；DYCZ-24DN型垂直电泳槽，DYCZ-40型电转仪（北京六一仪器厂）；5900型Real-timePCR仪（美国ABI公司）。

2、方法

2.1动物造模、分组及给药

采用数字表法随机分5组：假手术组，模型组，金香丹高、低剂量组及地奥心血康组，每组10只。根据人与大鼠体表面积换算，金香丹高、低组给予金香丹0.72,0.18g·kg-1灌胃[6]，假手术组和模型组每天予等体积生理盐水灌胃，地奥心血康组给予地奥心血康胶囊1.29g·kg-1灌胃，灌胃容量为10mL·kg-1，每天1次，共7d。

1%戊巴比妥钠（50mg·kg-1）腹腔注射麻醉，按文献[6]方法建立心肌缺血再灌注损伤模型，将大鼠背位固定于鼠板上，监测肢体Ⅱ导联心电图。分离气管并插管，即行动物人工呼吸机正压呼吸（频率54次/min，流量0.2mL·kg-1）。于胸骨左侧0.5cm处用手术刀从第3～5肋骨纵行切开1cm切口，分开肌层，剪断第4肋骨，剪开心包，暴露心脏，用左手压迫右侧胸腔及腹部将心脏挤出胸腔外，以左冠状动脉主干为标志，于左心耳根部下2mm处进针，以0号无损伤丝线穿过心肌浅层在肺动脉圆锥旁出针，立即将一根直径2mm的硅胶管置于血管与结扎线之间，除假手术组左冠脉前降支下只穿线不结扎外，其他组均结扎左冠脉前降支。以结扎后心电图ST段抬高明显为结扎成功标准，立即将心脏送回原位并关闭胸腔。结扎30min后剪断结扎线，ST段陡然下降1/2以上，显示再灌注成功。

2.2指标检测

2.2.1心电图检测

造模完成后，再灌注60min后，立即行肢体Ⅱ导联心电图检查，记录ST段变化（ΔST）。

2.2.2比色法检测心肌组织CK,LDH含量

取大鼠心肌组织100mg与生理盐水0.5mL匀浆，4℃，3000r·min-1离心10min（离心半径12cm，下同），取上清待测，放入-20℃冰箱保存。检测心肌组织CK：取心肌组织匀浆液200μL，按照试剂盒步骤加入样本和混合试剂，漩涡混匀，37℃孵育20min,4℃，3500r·min-1离心10min,45℃，水浴15min,660nm波长，0.5cm光径，比色检测吸光度A。检测心肌组织LDH：取心肌组织匀浆液200μL，按照试剂盒步骤加入样本和混合试剂，漩涡混匀，37℃孵育15min，加入2,4-二硝基苯肼，漩涡混匀，再37℃孵育15min，加入氢氧化钠溶液室温放置3min,4℃，3500r·min-1离心10min,440nm波长，1cm光径，比色检测各孔A，根据标准曲线换算为浓度。

2.2.3HE染色观察心肌组织病理学变化

4%多聚甲醛固定心肌组织72h后，脱水、包埋，4μm切片，脱蜡，HE染色，光镜下观察心梗边缘区组织形态。

2.2.4TNUEL法检测心肌组织细胞凋亡评估

石蜡切片（4μm），脱蜡，水化后加入蛋白酶K,37℃孵育20min，漂洗后加过氧化物酶封闭30min，加入TUNEL反应液50μL，暗湿盒反应（37℃，1h），漂洗，加入DAPI染核，暗湿盒反应（37℃，30min），抗荧光素淬灭剂，封片，荧光显微镜观察心肌细胞凋亡情况，拍照。利用ImageProPlus5.0软件分析，测定累积平均荧光强度。

2.2.5蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测心肌组织Bcl-2,Bax,NLRP3,IL-1β，Caspase-1蛋白表达

取大鼠心肌组织50mg,RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将浓度测定好的蛋白样品上样、转膜、封闭后，分别加入GAPDH,Bcl-2,Bax,NLRP3,IL-1β，Caspase-1一抗（均按1∶1000稀释），4℃冰箱过夜孵育；再次洗涤、加二抗（1∶5000）孵育、洗膜等处理后，用ECL超敏发光液显影，成像仪摄像、测量，利用ImageProPlus5.0软件分析计算积分光密度；以条带与各组内参GAPDH灰度值的比值作为各蛋白的相对表达量。

2.2.6Real-timePCR检测心肌组织NLRP3,IL-1β，Caspase-1mRNA表达

取心肌组织50mg，加TRIzol0.5mL提取总RNA，采用第一链cDNA合成试剂盒将RNA转录为cDNA。取cDNA4μL，加入上、下游引物各0.2μL进行QPCR扩增条件为95℃预变性10min,95℃变性15s,60℃退火30s,40个循环；72℃延伸5min。绘制扩增曲线溶解曲线，结果采用2-ΔΔCt法计算分析。引物序列为NLRP3上游5'-AGTAGGCTCTCCATCCATT-3'，下游5'-TCTGTCTGTCTGTCTGTCT-3'，长度190bp;IL-1β上游5'-GATGTTGCTGCTTCACTTC-3'，下游5'-CCTTGTTGGCTTATGTTCTG-3'，长度242bp;Caspase-1上游5'-TGCTACGCTCCGAATCTA-3'，下游5'-GTTCCACATCTGACTTAGGT-3'，长度136bp;GAPDH上游5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'，长度253bp，所有引物由武汉赛维尔生物科技有限公司设计合成。

2.3统计学方法

图片分析采用ImageJ软件分析，采用SPSS20.0软件对数据结果进行处理，结果以表示。采用单因素方差分析比较组间数据；两组间数据比较若符合正态分布并且方差齐性的数据采用最小显著性差异法（LSD）检验；若方差不齐，则采用Dunne't或LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1对大鼠心电图△ST，心肌组织CK和LDH含量的影响

心电图△ST结果显示，与假手术比较，模型组大鼠ST段显著升高（P<0.01），金香丹高、低剂量组和地奥心血康组ST段显著升高（P<0.01）；与模型组比较，金香丹高、低剂量组和地奥心血康组大鼠心电图ST段明显降低（P<0.05,P<0.01）；与地奥心血康组比较，金香丹低剂量组心电图ST段明显升高（P<0.05），金香丹高剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义。

心肌组织CK和LDH含量的结果显示，与假手术组比较，模型组心肌组织CK和LDH活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，金香丹高、低剂量组和地奥心血康组心肌组织CK和LDH活性明显降低（P<0.05,P<0.01）；与地奥心血康组比较，金香丹低剂量组CK和LDH活性明显升高（P<0.05），金香丹高剂量组LDH活性明显降低（P<0.05）。见表1。

3.2对大鼠心肌组织病理形态学变化的影响

大鼠心肌组织HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞排列整齐有序，横纹清晰，无纤维结构改变，无明显病理改变；模型组大鼠横纹断裂，细胞数量减少、排列紊乱，并出现大量细胞核固缩、偏移以及肌丝溶解，间质水肿；与模型组比较，金香丹高、低剂量和地奥心血康组预处理组上述病理改变均有不同程度减轻，其中以金香丹高剂量预处理组尤为显著，未见心肌纤维断裂、间质水肿不明显。见图1。

3.3对大鼠心肌细胞凋亡的影响

荧光染色蓝色是细胞核，绿色荧光是表示凋亡的细胞。与假手术组平均荧光强度（12.25±0.68）比较，模型组平均荧光强度（68.14±6.34）显著升高（P<0.01），提示心肌细胞凋亡程度增强；与模型组比较，金香丹高组平均荧光强度（20.78±1.01），低剂量组平均荧光强度（31.15±1.02）和地奥心血康组平均荧光强度（38.32±4.67）均明显下调（P<0.05,P<0.01），提示各组心肌细胞凋亡程度降低；与地奥心血康组平均荧光强度（38.32±4.67）比较，金香丹高剂量组，平均荧光强度（20.78±1.01）明显下调（P<0.05），提示心肌细胞凋亡程度降低。见图2。

3.4对大鼠心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达比值显著下降（P<0.01）；与模型组比较，金香丹高、低剂量组和地奥心血康组可提高Bcl-2和Bax的比值（P<0.01），其中金香丹高剂量组的数值最高，凋亡蛋白表达趋势与TUNEL检测结果保持一致。见图3，表2。

3.5对大鼠心肌组织NLRP3,IL-1β，Caspase-1蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组NLRP3,IL-1β，Caspase-1蛋白表达增高显著（P<0.01）；与模型组比较，金香丹高、低剂量组和地奥心血康组NLRP3,IL-1β，Caspase-1蛋白表达显著降低（P<0.01）；与地奥心血康组比较，金香丹低剂量组各蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。见图4，表3。

3.6对大鼠心肌组织NLRP3,IL-1β，Caspase-1mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组心肌组织NLRP3,IL-1β，Caspase-1mRNA表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，金香丹高、低剂量组和地奥心血康组NLRP3,IL-1β，Caspase-1mRNA表达显著降低（P<0.01）；与地奥心血康组比较，金香丹高剂量组NLRP3,Caspase-1mRNA表达明显降低（P<0.05,P<0.01）。见表4。

4、讨论

MIRI是缺血心肌组织恢复供血后损伤反而呈进行性加重的病理进程，可导致心肌细胞大量丢失，出现心电图失常，CK和LDH病理性增高等表现，有相当一部分病人因此最终走向心室重塑不良和心力衰竭[10]。目前尚无减轻MIRI的有效方法，因此及早干预尤为重要，而中医药在此方面有着独到的优势[11]。中医学并无MIRI的病名，但根据其发病特点和临床表现，可将其归属于“胸痹”“真心痛”范畴。中医理论认为MIRI的病机主要为“心脉痹阻”，多为本虚标实、虚实夹杂，其中气滞血瘀贯穿于发生发展全过程；虚则无力推动血液运行，实则阻碍脉道，气血运行不畅，血脉凝滞而成瘀血，血瘀又加重气滞，终致心脉痹阻而发病，故活血化瘀、行气止痛乃其有效治法[12]。

金香丹针对冠心病血脉运行障碍的病机特点，精心组合而成。方中以延胡索作为君药，具有活血化瘀的作用。青木香疏肝理气，行气止痛，郁金活血止痛，行气解郁俱为臣，两者结合，行气止痛。降香与丹参相伍，共奏行气活血、化瘀止痛之功效。全方药性平和，活血、行气之品，相济并用，使血脉通畅，瘀血消除，共成活血通脉、行气导滞之效。该方原本针对冠心病而创立，但其组方用药与MIRI病机相恰，可作为防治MIRI的有效药。现代药理实验表明，延胡索主要活性成分为原小檗碱类生物碱，具有镇痛、抗焦虑、抗心肌缺血、抗脑缺血等作用[13]；丹参提取物丹参酮，具有抗菌、抗炎等作用，可调节心肌细胞凋亡蛋白的表达，对大鼠心肌缺血再灌注模型具有保护作用[14]；郁金的主要成分姜黄素具有抗炎、免疫抑制等作用，能通过减少炎性损伤，抑制心肌细胞凋亡减轻心肌缺血再灌注损伤[15]；降香分离成分和粗提物具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗心绞痛、抗氧化等活性[16]。阔叶黄檀酚（latifolin）是一种从降香中提取的新黄酮类化合物，具有抗炎和保护心肌细胞的作用，可减轻心肌炎症来预防心肌梗死[17]。由此可见，金香丹防治MIRI不仅符合中医理论，而且现代药理研究提示具有抗炎作用。

最近研究认为，心肌损伤后过强、过长的炎症激活可影响心脏重塑进程，是心力衰竭进展的重要原因[18]。NLRP3炎症小体是急性炎症反应的关键蛋白复合物，负责激活炎症反应，其表达水平与MIRI病情严重程度密切相关。NLRP3炎症小体由NLRP3，凋亡相关的斑点样蛋白（ASC）和Caspase-1前体（pro-Caspase-1）组成，被激活后可通过Caspase-1将白细胞介素-1β前体（pro-IL-1β）切割成具有活性的IL-1β，进而引发炎症级联反应，造成炎性损伤和心肌细胞死亡[19]。在MIRI鼠模型中发现，心肌组织中NLRP3,Caspase-1,IL-1β的表达均上调，而抑制NLRP3炎症小体活化可减轻病灶炎症及心肌坏死，减少心肌损伤面积大小[20,21]，有效改善不良的左心室重构[22]。细胞凋亡是缺血再灌注引起心肌细胞损伤的主要方式，也是炎症反应所致一系列有害生化级联反应（黏附分子的表达上调、中心粒细胞浸润、成纤维细胞活化、血管内皮损伤等）的结果。在细胞凋亡信号通路中，Bcl-2蛋白和Bax蛋白作为Bcl-2家族的重要成员，发挥着关键作用。Bcl-2的抗凋亡作用与Bax的促凋亡作用相互拮抗，共同实现对细胞凋亡的调控，两者表达水平的平衡在调节心肌凋亡细胞死亡中起着至关重要的作用[23]。Bcl-2/Bax的值表示细胞凋亡的程度，当Bcl-2/Bax上升，细胞趋于存活；比值下降，细胞趋于凋亡，因此改善Bcl-2和（或）Bax蛋白表达，增加Bcl-2/Bax，可降低MIRI后心肌细胞的凋亡率[24]。

本研究结果显示，金香丹预处理可显著改善心肌组织病理损伤和降低MIRI模型大鼠的心肌损伤指标CK和LDH，提示减轻MIRI模型大鼠的心肌损伤；金香丹预处理提高Bcl-2/Bax，提示抑制细胞凋亡；金香丹预处理可减少心肌组织NLRP3,Caspase-1,IL-1β的表达，提示金香丹能减轻MIRI的炎症反应。因此，金香丹预处理能减轻MIRI模型大鼠的心肌损伤，其机制可能是抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路，阻断炎症反应，抑制心肌细胞凋亡。本研究明确金香丹调节炎症反应治疗MIRI的机制，为药物研发提供了实验依据，丰富临床应用。Bcl-2,Bax为内源性线粒体凋亡途径，本研究尚未评估心肌细胞线粒体相关功能，金香丹是否能调节心肌细胞线粒体功能有待进一步探讨。

文章来源：萧闵,向晶晶,王威,王朝阳.金香丹抑制NLRP3/IL-1β/Caspase-1信号通路缓解大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):87-94